2型糖尿病大鼠模型主動脈MMP-1、TIMP-1的表達(dá)變化和血管壁膠原代謝改變及吡格列酮的干預(yù)效應(yīng).pdf

1、目的：2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)大血管并發(fā)癥患病率是非糖尿病人群的3～5倍，是2型糖尿病患者的主要并發(fā)癥和致死的主要原因。而大血管病變的主要病理改變是動脈粥樣硬化。糖尿病與動脈粥樣硬化關(guān)系密切，表現(xiàn)為糖尿病患者出現(xiàn)動脈粥樣硬化的時間早、程度重和預(yù)后差，控制血糖可以明顯減少慢性微血管并發(fā)癥，但不能顯著降低動脈粥樣硬化所致的大血管并發(fā)癥?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein

2、ases，MMPs)是一大類能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和基底膜成分的鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，與結(jié)締組織的降解和重建有關(guān)。金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)為其特異性抑制劑。二者在體內(nèi)通過特定的途徑調(diào)節(jié)，若調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，將導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn)MMPs、TIMPs及二者的平衡失調(diào)與T2DM合并動脈粥樣

3、硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。過氧化物酶體增殖蛋白激活性受體γ(Peroxisome Proliferator-activatedreceptor-γ，PPARγ)是細(xì)胞核內(nèi)受體大家族成員，在脂質(zhì)和脂蛋白新陳代謝、葡萄糖代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZDs)類藥物是PPARγ的激動劑，可有效改善IR，降低血糖，糾正脂代謝紊亂，已日益廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療中。最

4、近研究表明：PPARγ參與了動脈血管炎癥反應(yīng)和AS的形成和發(fā)展，PPAR γ的活化可直接作用于血管壁，對血管壁具有保護作用。PPAR γ激動劑對血管炎癥的抑制作用可能對慢性炎癥疾病，尤其是糖尿病大血管并發(fā)癥的治療具有重要意義。羅格列酮和吡格列酮是目前最常用的TZDs類藥物，除降低高血糖、改善脂質(zhì)代謝紊亂，還有降低血壓、減少蛋白尿及抗動脈粥樣硬化等作用。膠原酶-1(MMP-1)主要裂解間質(zhì)I型、III型膠原，引起膠原變性，使其變得對明膠酶

5、的水解作用敏感，在ECM的降解過程中具有重要作用，作用于AS發(fā)生、發(fā)展過程中的所有關(guān)鍵環(huán)節(jié)。關(guān)于MMP-1與斑塊的穩(wěn)定性的研究較多，在動脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)水平較高，過度表達(dá)使斑塊破裂的危險增加。目前對MMP-1在糖尿病大血管病變早期病變中的作用的研究較少。本試驗研究目的在于觀察鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的高脂高糖喂養(yǎng)的糖尿病大鼠模型中大動脈壁MMP-1、TIMP-1的表達(dá)變化，并應(yīng)用吡格列酮進行干預(yù)，觀察其

6、對MMP-1、TIMP-1表達(dá)及血管內(nèi)皮功能的影響，探討吡格列酮在糖尿病大血管病變中的作用機制，并為預(yù)防和延緩糖尿病大血管病變提供有力理論依據(jù)和有效治療方法。 方法：健康雄性SD大鼠45只，8周齡，體重216±15g，由河北省實驗動物中心提供。隨機分為正常對照組(NC組)15只和實驗組30只，NC組喂以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，實驗組喂以高糖高脂高熱量飼料，4周后實驗組給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg，NC組大鼠給予同等劑量檸檬酸

7、鈉緩沖液腹腔注射，各組以原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)2周后，內(nèi)眥靜脈取血測空腹血糖≥7.8mmol/L者為糖尿病大鼠。再將糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組(DM組)和吡格列酮干預(yù)組(PIO組)。PIO組每日給予吡格列酮11mg/(Kg·d)灌胃治療，NC組及DM組每日給予同PIO組等體積的生理鹽水灌胃。實驗?zāi)㎞C組剩余大鼠15只，DM組12只，PIO組13只。每組大鼠于實驗開始、注射STZ前及注射STZ兩周后和實驗結(jié)束稱重、取血。大鼠自采血前一日20:00

8、起禁食，實驗日8:00分別從內(nèi)眥靜脈采血3ml，分離血清，-20℃保存，用于各指標(biāo)的檢測。于第14周末(即造模成功后8周)處死動物，留取胸主動脈4％中性多聚甲醛固定，待組織學(xué)檢查。 1.血糖、胰島素測定血糖采用葡萄糖氧化酶法測定。空腹胰島素(FINS)采用放射免疫法測定。應(yīng)用穩(wěn)態(tài)模式評估法胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及空腹胰島素敏感性指數(shù)(ISI)評價胰島素抵抗的程度。 2.血脂的測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC

9、)采用比色法測定(以mmol/L計)。FFAs用Cu+比色法測定。 3血管內(nèi)皮功能生化指標(biāo)的測定血漿內(nèi)皮素(ET)采用放射免疫分析法測定，單位：pg/ml。血清NO測定采用硝酸還原酶法，單位：μmol/L。 4動脈組織形態(tài)學(xué)檢查常規(guī)方法制備大鼠動脈光鏡組織切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，Masson染色，免疫組織化學(xué)染色。 5統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組

10、間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析。顯著性用P值表示，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。 結(jié)果： 1實驗開始時大鼠隨機分組，各組體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差別。高糖高脂喂養(yǎng)1月時即注射STZ前大鼠實驗組體重明顯高于NC組，差異有極顯著性(P＜0.01)。造模成功后大鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，體重明顯下降，活動減弱，一般狀態(tài)差。實驗?zāi)㏄IO組和DM組體重明顯高于NC組，有極

11、顯著性差異(P＜0.01)，PIO組較DM組體重下降，有顯著性差異(P＜0.05)。 2.STZ造模前各組大鼠空腹血糖無差別。腹腔注射STZ后2周時，實驗組血糖明顯高于對照組，有極顯著性差異(P＜0.01)。實驗?zāi)㏄IO組血糖低于DM組(P＜0.05)，但兩組血糖仍高于NC組，有極顯著性差異(P＜0.01)。造模前實驗組胰島素水平明顯高于NC組，有極顯著性差異(P＜0.01)。實驗?zāi)〥M組與PIO組胰島素水平仍高于對照組，有顯著

12、性差異(P＜0.05)，PIO組胰島素水平低于DM組，有顯著性差異(P＜0.05)。造模前實驗組大鼠的TC、TG、FFA均明顯高于NC組，有顯著性差異(P＜0.01)。實驗?zāi)㏄IO組的TC、TG、FFA明顯低于DM組(P＜0.05)，但仍高于NC組(P＜0.05)。造模前實驗組大鼠的ET均明顯高于NC組，有顯著性差異(P＜0.01)。實驗?zāi)㏄IO組的ET低于DM組(P＜0.05)，但仍高于NC組(P＜0.05)。造模前實驗組大鼠的NO均

13、明顯低于NC組，有顯著性差異(P＜0.01)。實驗?zāi)㏄IO組的NO高于DM組(P＜0.05)，但仍低于NC組(P＜0.05)。 3.組織學(xué)觀察顯示：實驗?zāi)┕忡R下NC組大鼠動脈壁未見明顯病理變化，糖尿病大鼠動脈壁出現(xiàn)局限性內(nèi)膜增厚，但未見大量泡沫細(xì)胞等典型AS病理改變。主動脈橫斷面上可見較多的內(nèi)膜增厚病灶，病灶處內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性斷裂或缺失，內(nèi)彈力板厚薄不均，有斷裂分離現(xiàn)象，中膜淺層SMC輕度增生、排列紊亂。Masson染色：NC組動

14、脈壁膠原含量較少，內(nèi)膜和中膜僅見少量綠染區(qū)域；DM組和PIO組內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜綠染區(qū)明顯增加，紅色的平滑肌細(xì)胞周圍可見綠染；計算機圖文分析染為綠色總面積占統(tǒng)計場總面積的百分比對膠原含量進行半定量，并做統(tǒng)計學(xué)分析顯示：實驗組與NC組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，PIO組較DM組膠原含量減少，有顯著性差異(P＜0.05)。 4免疫組化檢測顯示實驗?zāi)㎞C組主動脈MMP-1、TIMP-1表達(dá)較少，僅內(nèi)皮細(xì)胞胞漿少量表達(dá)。DM組MM

15、P-1、TIMP-1表達(dá)明顯增多，陽性細(xì)胞呈棕黃色，定位于細(xì)胞漿，內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)膜下區(qū)域可見陽性表達(dá)，與NC組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而PIO組表達(dá)水平低于DM組，高于NC組有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射成功制備2型糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠模型8周時即出現(xiàn)動脈粥樣硬化早期病理改變。 2.2型糖尿病大鼠主動脈早期大血管病變中MMP-1與TIMP-1的表達(dá)