核酸探針用于核酸復(fù)制與酶活性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及點(diǎn)突變分析.pdf

1、核酸的復(fù)制是生命現(xiàn)象中最本質(zhì)的內(nèi)容之一，獲取有關(guān)核酸和聚合酶作用的實(shí)時(shí)過程信息將有助于DNA復(fù)制過程機(jī)理的研究，而且還將為藥物的篩選提供新的技術(shù)手段。傳統(tǒng)的研究DNA復(fù)制過程的分析方法往往采用放射性標(biāo)記結(jié)合凝膠電泳的方法，無法獲取它們的動(dòng)力學(xué)過程信息，因此發(fā)展實(shí)時(shí)的研究DNA復(fù)制過程的分析方法很有意義。 許多疾病如癌癥和遺傳病的發(fā)生都與基因的突變有關(guān)，因此對(duì)特定序列DNA的分析以及對(duì)DNA鏈中堿基突變的檢測(cè)在基因篩選、遺傳疾病的

2、早期診斷和治療方面具有十分重要的意義。發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、特異的檢測(cè)方法用于基因突變研究是非常重要的。 本論文針對(duì)上述兩個(gè)問題，利用分子信標(biāo)熒光探針和熒光染料探針，發(fā)展了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA連續(xù)復(fù)制、聚合酶活性以及基于聚合反應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型方法。主要內(nèi)容包括以下三個(gè)方面：1、分子信標(biāo)體外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA連續(xù)復(fù)制過程。利用分子信標(biāo)實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA連續(xù)復(fù)制過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，分子信標(biāo)作為DNA連續(xù)復(fù)制反應(yīng)的模板和檢測(cè)分子，實(shí)時(shí)準(zhǔn)確

3、地獲取了DNA連續(xù)復(fù)制過程的信息。與傳統(tǒng)的研究方法相比，該方法避免了放射性同位素標(biāo)記、變性凝膠電泳、放射性自顯影等復(fù)雜的操作，為DNA連續(xù)復(fù)制過程研究提供了一種新的非同位素分析方法，并在此基礎(chǔ)上建立了快速準(zhǔn)確的檢測(cè)KlenowFragment(exo-)聚合酶的分析方法。拓展了分子信標(biāo)用于核酸和蛋白質(zhì)相互作用研究的應(yīng)用領(lǐng)域。 2、發(fā)展了一種簡(jiǎn)便快速的聚合酶活性實(shí)時(shí)檢測(cè)新方法?；陔p鏈DNA結(jié)合染料能特異嵌入雙鏈DNA發(fā)出熒光的原

4、理，發(fā)展了一種實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA聚合酶活性的簡(jiǎn)便方法。在檢測(cè)過程中，聚合酶的聚合反應(yīng)進(jìn)程被實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)，通過監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)聚合酶的活性及藥物對(duì)聚合酶活性的影響。該方法不需要對(duì)寡核苷酸或dNTP進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記和熒光標(biāo)記，也不需要聚丙烯酰胺凝膠電泳和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種簡(jiǎn)便、快速價(jià)廉的聚合酶活性實(shí)時(shí)檢測(cè)新方法，為研究抗腫瘤藥物對(duì)聚合酶活性的影響提供了一種簡(jiǎn)捷方法，也將為相關(guān)疾病診治和藥物篩選提供一種新的思路。

5、3、建立了基于等位特異性延伸的SNP基因分型新方法以及用于β地中海貧血點(diǎn)突變的檢測(cè)?；趩螇A基變化造成的堿基互補(bǔ)性對(duì)引物延伸反應(yīng)的影響，以及染料SYBRGreenI與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)熒光的性質(zhì)來識(shí)別有無聚合反應(yīng)，從而達(dá)到對(duì)SNP位點(diǎn)的分析。該方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，無需合成標(biāo)記探針，不需要昂貴的實(shí)時(shí)熒光PCR儀，是一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、特異性好的基因分型方法。運(yùn)用此方法準(zhǔn)確、快速地實(shí)現(xiàn)了β地中海貧血遺傳性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因分型。這