核酸探針用于核酸復制與酶活性的實時監(jiān)測及點突變分析.pdf

1、核酸的復制是生命現(xiàn)象中最本質的內容之一，獲取有關核酸和聚合酶作用的實時過程信息將有助于DNA復制過程機理的研究，而且還將為藥物的篩選提供新的技術手段。傳統(tǒng)的研究DNA復制過程的分析方法往往采用放射性標記結合凝膠電泳的方法，無法獲取它們的動力學過程信息，因此發(fā)展實時的研究DNA復制過程的分析方法很有意義。 許多疾病如癌癥和遺傳病的發(fā)生都與基因的突變有關，因此對特定序列DNA的分析以及對DNA鏈中堿基突變的檢測在基因篩選、遺傳疾病的

2、早期診斷和治療方面具有十分重要的意義。發(fā)展簡便、快速、特異的檢測方法用于基因突變研究是非常重要的。 本論文針對上述兩個問題，利用分子信標熒光探針和熒光染料探針，發(fā)展了實時監(jiān)測DNA連續(xù)復制、聚合酶活性以及基于聚合反應的單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型方法。主要內容包括以下三個方面：1、分子信標體外實時監(jiān)測DNA連續(xù)復制過程。利用分子信標實現(xiàn)了對DNA連續(xù)復制過程的實時監(jiān)測，分子信標作為DNA連續(xù)復制反應的模板和檢測分子，實時準確

3、地獲取了DNA連續(xù)復制過程的信息。與傳統(tǒng)的研究方法相比，該方法避免了放射性同位素標記、變性凝膠電泳、放射性自顯影等復雜的操作，為DNA連續(xù)復制過程研究提供了一種新的非同位素分析方法，并在此基礎上建立了快速準確的檢測KlenowFragment(exo-)聚合酶的分析方法。拓展了分子信標用于核酸和蛋白質相互作用研究的應用領域。 2、發(fā)展了一種簡便快速的聚合酶活性實時檢測新方法?；陔p鏈DNA結合染料能特異嵌入雙鏈DNA發(fā)出熒光的原

4、理，發(fā)展了一種實時檢測DNA聚合酶活性的簡便方法。在檢測過程中，聚合酶的聚合反應進程被實時轉換為熒光信號，通過監(jiān)測熒光強度的變化實時檢測聚合酶的活性及藥物對聚合酶活性的影響。該方法不需要對寡核苷酸或dNTP進行放射性同位素標記和熒光標記，也不需要聚丙烯酰胺凝膠電泳和聚合酶鏈式反應，是一種簡便、快速價廉的聚合酶活性實時檢測新方法，為研究抗腫瘤藥物對聚合酶活性的影響提供了一種簡捷方法，也將為相關疾病診治和藥物篩選提供一種新的思路。

5、3、建立了基于等位特異性延伸的SNP基因分型新方法以及用于β地中海貧血點突變的檢測?；趩螇A基變化造成的堿基互補性對引物延伸反應的影響，以及染料SYBRGreenI與雙鏈DNA結合發(fā)熒光的性質來識別有無聚合反應，從而達到對SNP位點的分析。該方法實驗設計簡單，無需合成標記探針，不需要昂貴的實時熒光PCR儀，是一種快速、簡便、經濟、特異性好的基因分型方法。運用此方法準確、快速地實現(xiàn)了β地中海貧血遺傳性相關的單核苷酸多態(tài)性位點的基因分型。這