桑樹脫落酸生物合成及裂解相關(guān)基因的鑒定及在桑椹生長發(fā)育中的表達(dá)分析.pdf

1、桑樹（Morus alba L.）是一種多年生的木本植物，其葉可以養(yǎng)蠶，而其果實——桑椹因其含有豐富的黃酮類物質(zhì)以及良好的口感倍受人們的喜愛。然而，桑椹成熟期短，易脫落的特性嚴(yán)重削弱了桑椹的經(jīng)濟(jì)價值。
　　脫落酸（abscisic acid，ABA）被證明是果實成熟調(diào)控的一個重要調(diào)控因子，參與果實中色素、糖分的積累，果實成熟、軟化，以及控制果實的脫落。而對于ABA在桑椹成熟和脫落過程中調(diào)控機(jī)制的研究鮮見報道。本研究以果桑新品種‘嘉

2、陵40號’果實為材料，采用生物信息學(xué)的方法，鑒定 ABA生物合成相關(guān)基因，通過相關(guān)生理生化和分子生物學(xué)方法分析ABA在桑椹成熟和脫落中的調(diào)控機(jī)制，旨在為解決桑椹成熟期短、易脫落的問題提供理論基礎(chǔ)。同時以桑樹幼苗為材料，探究脅迫環(huán)境下NCEDs基因的表達(dá)，以及ABA、氟啶酮對于幼苗生長的影響，實驗結(jié)果如下：
　　1.桑樹脫落酸生物合成及裂解相關(guān)基因的鑒定及生物信息學(xué)分析
　　從川?；蚪M數(shù)據(jù)庫鑒定出6個ABA合成基因，包括1個

3、MnAAO、2個MnZEP和3個MnNCED基因。對其DNA及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析結(jié)果表明，MnNCED1-3氨基酸序列高度保守，聚類分析表明它們與雙子葉果樹 NCEDs序列同源性較高，與單子葉植物同源性較低；轉(zhuǎn)錄分析表明它們在葉中轉(zhuǎn)錄水平相對高于其他組織，在根中最低。與其他基因相比，MnNCED2和MnNCED3在根、皮、冬芽、雄花、葉中的轉(zhuǎn)錄水平較高。
　　從川?；蚪M鑒定出6個編碼脫落酸裂解酶——8’-羥化酶相關(guān)基因，即

4、MnCYP707A1-6.轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)表明除MnCYP707A1在根和冬芽以及MnCYP707A1在雄花中不表達(dá)外，這些基因在桑樹5個組織中均有表達(dá)。
　　2.桑椹成熟過程中脫落酸含量變化
　　隨著桑椹的生長發(fā)育，其ABA含量在盛花期后第8天（青熟期）出現(xiàn)一個弱峰，從盛花期后第14天（綠熟期）開始逐漸增加，伴隨ABA含量增加果實的成熟和著色的速度也出現(xiàn)較大提高，果重增加，果實開始迅速軟化。直到盛花期后第37天（紫熟期）ABA含量

5、到達(dá)最高，果實達(dá)到完全成熟階段。
　　3.外源脫落酸、氟啶酮對桑果脫落以及成熟的影響
　　將處理后的果實，經(jīng)連續(xù)7 d的脫落個數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，ABA處理后的桑果脫落時間，比無菌水處理的桑果脫落時間明顯縮短，而氟啶酮處理后的桑果脫落時間明顯延長。此外，ABA處理后處于完全成熟期的桑椹所占的比率升高，而氟啶酮處理后降低，同時蔗糖和葡萄糖也促進(jìn)了果實的成熟。
　　4.脫落酸合成及裂解相關(guān)基因在果實成熟過程中的表達(dá)
　　桑椹

6、成熟過程中的ABA合成相關(guān)基因的表達(dá)呈現(xiàn)一定的差異。在各個時期中，MnNCED2的表達(dá)量都維持在較高的水平，MnZEP1和MnZEP2表達(dá)量相對較低，MnNCED1、MnNCED3和MnAAO表達(dá)量最低。MnNCED2和 MnNCED3都是在果實成熟后期的表達(dá)量較高，MnNCED1在果實盛花期后第21天達(dá)到峰值，以后呈下降趨勢，直到盛花期后第37天才略有上升。而MnAAO、MnZEP1和MnZEP2在前期的表達(dá)量相對于后期較高，后期表達(dá)

7、量趨于穩(wěn)定或到末期才略有升高。利用SPSS軟件對ABA含量和ABA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，MnNCED2和MnNCED3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與ABA含量相關(guān)性較高。
　　離體桑椹經(jīng)ABA處理后，MnNCED1、MnAAO和MnZEP1的轉(zhuǎn)錄水平直到第4天才出現(xiàn)上調(diào)，MnNCED3在第3天和第4天被上調(diào)，MnZEP2一直上調(diào)；氟啶酮處理后MnNCED1和MnZEP2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量只在第1天和第3天被下調(diào)，MnAAO和MnZEP

8、1只在第4天升高，MnZEP1只在處理后第1天被下調(diào)，MnNCED2在ABA和氟啶酮處理后均被下調(diào)。
　　在桑椹成熟過程中，MaCYP707A1，MaCYP707A2，MaCYP707A3和MaCYP707A4在果實成熟早期表達(dá)量較高，而在果實成熟晚期表達(dá)量較低，并與內(nèi)源ABA含量的變化相反，表明這4個基因可能是ABA裂解過程的主效基因，并對ABA含量的調(diào)控具有重要的作用。
　　5.脫落酸、氟啶酮、鎢酸鈉、甘露醇對于桑幼苗生

9、長和NCEDs表達(dá)的影響
　　桑幼苗經(jīng)ABA、甘露醇、鎢酸鈉、氟啶酮處理后根莖的長度相比于對照均出現(xiàn)顯著地下降，ABA、甘露醇處理后幼苗的根莖比出現(xiàn)上調(diào)，而ABA合成抑制劑氟啶酮、鎢酸鈉處理后根莖比下降，鎢酸鈉處理后減少幅度最大。ABA處理后幼苗NCED2、NCED3基因在根莖葉中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均被下調(diào)；甘露醇處理后，根莖葉中NCED2的表達(dá)水平均被上調(diào)，鎢酸鈉處理后，NCED2基因在莖葉中的表達(dá)被上調(diào)，而在跟中的表達(dá)被抑制，而N