激肽釋放酶蛋白質(zhì)治療腦缺血再灌注損傷及可能的機制.pdf

1、缺血性腦卒中是引起人類非自然死亡和致殘的主要疾病之一。激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system，KKS)作為公認的炎癥調(diào)節(jié)系統(tǒng)在缺血性腦血管病不同時期的病理過程中發(fā)揮多種重要作用。KKS系統(tǒng)中主要成分之一激肽釋放酶又可分為組織型和血漿型兩類。近年來在腦缺血實驗研究及臨床應用中均發(fā)現(xiàn)，其中的組織型Kallikrein(文中的Kallikrein均指組織型)對缺血狀況下腦組織有明確的保護作用。然而，由于大分子物質(zhì)

2、難以逾越血腦屏障及生物膜，這就限制了許多大分子藥物對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。近年建立的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(Protein transduction)或稱為蛋白質(zhì)治療(Protein therapy)的技術不僅能使生物大分子高效地跨過血腦屏障和穿越生物膜進入細胞，而且能使進入胞內(nèi)的生物大分子物質(zhì)保持其原有的生物活性。 本研究首先構建了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導域．激肽釋放酶(Protein transductiondomain-kallikrein，PTD-

3、kaUikrein)復合物，并對其穿透功能和生物毒性進行驗證。為排除復雜體內(nèi)環(huán)境的影響，在第二部分工作中，應用PTD-kallikrein及緩激肽受體B2的特異性抑制劑對缺糖、缺氧(Oxygen-glucose depriration，OGD)再復糖、復氧的體外培養(yǎng)神經(jīng)元模型進行了干預，觀察了PTD-kallikrein對該條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元保護作用，并探討了其可能的作用機制。在第三部分工作中，我們又對局灶性腦缺血大鼠進行了干預，以進一

4、步驗證PTD-kaUikrein對腦缺血大鼠的腦保護作用和可能的機制。本研究擬通過了解PTD-kallikrein對腦缺血再灌注損傷的蛋白質(zhì)治療及作用機制，為腦缺血的治療提供新的途徑和方法。 第一部分PTD-kallikrein的合成及其對生物膜、血腦屏障通透功能的鑒定 人工合成PTD肽段(氨基酸序列：RRRRRRRRRGC)，用化學交聯(lián)法構建PTD-kallikrein。將熒光標記的 PTD-kallikrein及Ka

5、llikrein分別孵育不同細胞，在熒光顯微鏡下觀察兩種熒光物質(zhì)對生物膜的通透能力。正常大鼠尾靜脈注射PTD-kallikrein及Kallikrein，2.5h后斷頭取腦組織勻漿，Western-blot測定腦內(nèi)Kallikrein含量的變化，以觀察其對血腦屏障的通透能力。另用不同濃度的PTD肽段分別孵育不同細胞，MTT法檢測細胞生存率，觀察PTD肽段對細胞是否有毒性作用。結果顯示：1．PTD-kallikrein可以通過生物膜及跨越

6、血腦屏障；2．PTD肽段本身對細胞無明顯的毒性作用。 第二部分 PTD-kallikrein對缺糖、缺氧后再恢復的神經(jīng)元的保護作用 原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，然后給予OGD1.5h后復糖、復氧。除對照組外，其余各干預阻在OGD前24h分別給予100nmol/l的B2受體抑制劑HOE140和/或10、50及100 nmol/l的PTD-kallikrein、Kallikrein，復糖、復氧后4h采用MTT法測定細胞生存率，T

7、UNEL測定細胞凋亡。結果顯示：1．PTD-kallikrein可顯著提高缺糖、缺氧再復糖、復氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元生存率并減少其凋亡；2．B2受體抑制劑能明顯抑制PTD-kallikrein對神經(jīng)元的保護。 第三部分PTD-kallikrein對大鼠MCAO模型缺血再灌注損傷的保護作用 制作大鼠左側(cè)大腦中動脈梗塞模型，缺血90min后恢復再灌流。除假手術組外，其余各干預阻分別在缺血再灌流后即刻尾靜脈給予2ml/kg的生理

8、鹽水、0.75nmol/kg的B2受體抑制劑bradyzide和/或3.15×10<'-2>nmol/kg的PTD-kallikrein、Kallikrein2生行干預。再灌流24h后處死動物，NSS量表測定神經(jīng)功能評分,TTC染色測定梗死體積，ELISA測定細胞因子IL-1β、TNF-α及PGE<,2>的分泌。結果顯示：1．PTD-kallikrein能顯著改善腦缺血導致的神經(jīng)功能障礙、減小梗死體積、抑制細胞因子IL-1β、TNF-α

9、及PGE<,2>的的釋放；2．B2受體抑制劑能明顯抑制PTD-kallikrein的神經(jīng)保護作用。 結論 1．PTD-kallikrein可以高效地通過生物膜及跨越血腦屏障且對細胞無明顯毒性作用； 2．PTD-kallikrein對缺糖、缺氧再復糖、復氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元及大鼠MCAO模型缺血再灌注損傷均有一定的保護作用； 3．PTD-kallikrein的保護作用可能是通過B2受體的介導而發(fā)揮其功效的。