縫隙連接在異丙酚保護(hù)腦缺血再灌注損傷中的作用及可能機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1.探討縫隙連接在異丙酚抗大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及可能的分子機(jī)制
　　方法：
　　1.采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型；為了對(duì)異丙酚腦保護(hù)作用的濃度進(jìn)行篩選，將50只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)（sham）組、缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）組、低（I/R+P25，25mg/kg）、中（I/R+P50，50mg/kg）、高劑量（I/R+P100，

2、100mg/kg）異丙酚干預(yù)缺血再灌注組。為了研究異丙酚腦保護(hù)作用的分子機(jī)制，進(jìn)一步將50只 SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：sham組、I/R組、I/R+P100組、甘珀酸（carbenoxolone， CBX）干預(yù)缺血再灌注（I/R+CBX）組和高劑量的異丙酚+甘珀酸干預(yù)缺血再灌注（I/R+P100+CBX）組。采用 Longa’s法對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分；TTC染色法檢測(cè)大鼠腦梗死體積的變化；Western Blot法檢測(cè)大鼠腦

3、組織中縫隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）、蛋白激酶C（PKC）以及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)變化。
　　2.利用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，制備缺氧/復(fù)氧損傷的細(xì)胞模型。為了對(duì)異丙酚保護(hù)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的濃度進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照（control）組、缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）組、低（H/R+P25，25μmol/L）、中（H/R+P50，50μmol/L）、高

4、劑量（H/R+P100，100μmol/L）異丙酚干預(yù)缺氧/復(fù)氧組。為了研究異丙酚保護(hù)作用機(jī)制，將實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分為：control組、H/R組、H/R+P100組、異丙酚高劑量+縫隙連接增強(qiáng)劑（retinoid acid，RA）干預(yù)缺氧/復(fù)氧（ H/R+P100+RA）組、異丙酚高劑量+縫隙連接抑制劑（carbenoxolone，CBX）干預(yù)缺氧/復(fù)氧（H/R+P100+CBX）組和異丙酚高劑量+PKC激酶抑制劑GF109203X干預(yù)缺氧

5、/復(fù)氧(H/R+P100+GF)組。分別采用MTT法和Hoechst33258檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率及細(xì)胞凋亡情況；熒光示蹤法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙連接功能的變化；Western Blot檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43、PKC以及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.各實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和 TTC染色的結(jié)果顯示：與 I/R組相比，除I/R+P25組外，I/R+P50、I/R+P100組神經(jīng)行

6、為學(xué)評(píng)分和大鼠腦梗死體積百分率都有不同程度的降低，且 I/R+P100組效果更佳，甘珀酸可以進(jìn)一步增強(qiáng)異丙酚對(duì)大鼠腦I/R損傷的保護(hù)作用。
　　2.各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中Cx43、PKC、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)變化的檢測(cè)結(jié)果顯示：較sham組，I/R組的Cx43蛋白表達(dá)以及Bax與Bcl-2比值顯著增高，而PKC蛋白表達(dá)水平顯著降低；與I/R組相比，I/R+P100組的Cx43蛋白表達(dá)及Bax與Bcl-2比值明顯降低，而PKC蛋

7、白表達(dá)則明顯增多，且甘珀酸可以增強(qiáng)異丙酚對(duì)蛋白表達(dá)變化的作用。
　　3.星形膠質(zhì)細(xì)胞純度的鑒定結(jié)果顯示：星形膠質(zhì)細(xì)胞純度為96.3％±1.2%，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　4.星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果顯示：與H/R組相比，除H/R+P25組外，H/R+P50、H/R+P100組細(xì)胞存活率均明顯增高，且高劑量的異丙酚增高效果更佳；甘珀酸使異丙酚對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用增強(qiáng)，但維甲酸和GF卻使異丙酚的保護(hù)作用減弱。

8、r>　　5.星形膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙連接功能的檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組的星形膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙連接功能明顯增強(qiáng)；與H/R組相比，H/R+P100組的縫隙連接功能顯著降低，且甘珀酸可以進(jìn)一步降低H/R+P100組的縫隙連接功能；較H/R+P100組，H/R+P100+RA組和H/R+P100+GF組的細(xì)胞間的縫隙連接功能則顯著增強(qiáng)。
　　6.星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43和PKC蛋白表達(dá)變化的檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比

9、，H/R組的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)明顯增高，PKC蛋白表達(dá)顯著降低；與H/R組相比，H/R+P100組的Cx43蛋白表達(dá)明顯降低，而PKC蛋白表達(dá)明顯增高，且甘珀酸可以增強(qiáng)異丙酚的這一作用；較 H/R+P100組， H/R+P100+RA組和H/R+P100+GF組的Cx43蛋白表達(dá)均有不同程度的增加，但PKC蛋白表達(dá)均有不同程度降低。
　　7.星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)結(jié)果顯示：與control組相比，H/R組細(xì)胞凋亡率明

10、顯增加；與H/R組相比，H/R+P100組細(xì)胞凋亡率明顯降低，且甘珀酸可以增強(qiáng)異丙酚的這一作用；較H/R+P100組，H/R+P100+RA組和H/R+P100+GF組的細(xì)胞凋亡率均有不同程度的增加。
　　8.各實(shí)驗(yàn)組星形膠質(zhì)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)變化檢測(cè)結(jié)果顯示：與control組相比，H/R組Bax與Bcl-2的比值顯著增高；與H/R組相比，使用高劑量異丙酚后 Bax與 Bcl-2的比值明顯降低，且甘珀酸

11、可以使H/R+P100組Bax與Bcl-2的比值進(jìn)一步降低；較H/R+P100組，H/R+P100+RA組和H/R+P100+GF組的Bax與Bcl-2的比值均有不同程度的增高。
　　結(jié)論：
　　1.異丙酚對(duì)腦 I/R損傷有一定的保護(hù)作用，尤其以高劑量（100mg/kg）的異丙酚保護(hù)作用更佳。
　　2.異丙酚對(duì)腦I/R損傷保護(hù)作用的機(jī)制可能與通過PKC信號(hào)通路抑制縫隙連接功能有關(guān)。
　　3.異丙酚降低腦I/R損傷