2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景及目的: 小梁細(xì)胞位于前房角的小梁網(wǎng)組織中,含有多種細(xì)胞因子受體,能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等多種成分,是維持小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)及功能,保持房水外引流通暢的重要因素。小梁細(xì)胞功能障礙可導(dǎo)致房水外流阻力增大,眼壓升高引發(fā)青光眼。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性開角型青光眼患者的小梁細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常人,小梁網(wǎng)組織中ECM含量增加。因此,深入研究調(diào)節(jié)小梁細(xì)胞增殖、凋亡和分泌功能的分子機(jī)制,對明確青光眼的發(fā)病機(jī)制以及指導(dǎo)青光眼的

2、治療具有重要的意義。 NF-κB是一個廣泛存在于細(xì)胞中具有多向調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞生長分化、增殖、凋亡、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等生理及病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。NF-κB的活化是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),NF-κB的過度活化與許多急慢性炎性相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在青光眼的發(fā)生、發(fā)展及臨床治療過程中,時常伴有炎癥的發(fā)生,尤其是在外傷、葡萄膜炎所致的繼發(fā)性青光眼的發(fā)病過程中,前房炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子,必然會

3、刺激小梁細(xì)胞NF-κB的活化。壓力應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞NF-κB的活化,研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性青光眼小梁網(wǎng)NF-κB的表達(dá)也明顯高于正常人,而NF-κB的活化對青光眼的進(jìn)程將會產(chǎn)生何種影響,目前仍不清楚。 NF-κB的活化對細(xì)胞生存至關(guān)重要,NF-κB可通過直接調(diào)控與細(xì)胞增殖相關(guān)基因及抗凋亡基因的表達(dá),參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控。此外,NF-κB還可以調(diào)控多種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。臨床上長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致繼發(fā)性青光眼的發(fā)生,而糖皮質(zhì)激

4、素是NF-κB的拮抗劑,長期應(yīng)用激素使NF-κB活性被過度抑制,繼而引發(fā)小梁細(xì)胞的凋亡是否是激素性青光眼的發(fā)病機(jī)制,目前亦尚不清楚。 為此,本研究擬以NF-κB為切入點,通過培養(yǎng)人眼小梁細(xì)胞,將NF-κB的活性亞基P65/RelA基因轉(zhuǎn)染入小梁細(xì)胞,觀察NF-κB在小梁細(xì)胞中的過度表達(dá)對小梁細(xì)胞的增殖、凋亡,以及基質(zhì)金屬蛋白酶和TIGR基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響。另一方面,采用圈套策略,即應(yīng)用與NF-κB順式作用元件序列同源的寡核苷酸

5、序列抑制小梁細(xì)胞NF-κB的活化,觀察其對小梁細(xì)胞增殖、凋亡,以及基質(zhì)金屬蛋白酶和TIGR基因的表達(dá)變化的影響。本課題試圖闡述NF-κB在小梁細(xì)胞功能障礙中的作用,了解NF-κB在不同活性情況下對小梁細(xì)胞的影響,討論其與青光眼發(fā)生的可能性。 材料方法: 人眼小梁細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定:利用角膜移植術(shù)的供體眼組織,應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)小梁細(xì)胞,采用免疫組化SP法,進(jìn)行纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原、TIGR

6、蛋白及Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定。 細(xì)胞分組:采用培養(yǎng)在三到五代的小梁細(xì)胞進(jìn)行實驗,隨機(jī)分為5組,正常對照組(C),空質(zhì)粒對照組(P65-C),P65質(zhì)粒組(P65),隨機(jī)圈套對照組(ODN-C),NF-κB圈套核苷酸組(ODN)P65質(zhì)粒及NF-κB圈套核苷酸細(xì)胞轉(zhuǎn)染:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,利用熒光顯微鏡及WesternBolt法檢測轉(zhuǎn)染效果。 P65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后小梁細(xì)胞培養(yǎng)液TNF-α含量檢測:轉(zhuǎn)染后24小時用ELISA法檢測細(xì)

7、胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量。 NF-κB對小梁細(xì)胞增殖及凋亡的影響:分別應(yīng)用MTT及3H-TdR摻入實驗檢測小梁細(xì)胞的增殖情況,用Tunel法檢測小梁細(xì)胞的凋亡。 NF-κB對小梁細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其抑制劑(TIMlP)表達(dá)的影響:應(yīng)用RT-PCR方法檢測小梁細(xì)胞MMP-1,MMP-2,MMP-3及TIMP-1,TIMP-2mRNA的表達(dá)情況。 NF-κB對小梁細(xì)胞TIGR基因表達(dá)調(diào)控的影響:應(yīng)用RT

8、-PCR及WesternBlot法分別檢測TIGR基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果: 人眼小梁細(xì)胞培養(yǎng)成功,免疫組化鑒定LN、FN、Ⅳ型膠原及TIGR基因表達(dá)為陽性,Ⅷ因子相關(guān)抗原為陰性。 P65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24小時,小梁細(xì)胞P65的表達(dá)明顯升高,細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量顯著升高。 P65高表達(dá)抑制小梁細(xì)胞的增殖及DNA合成,促進(jìn)小梁細(xì)胞凋亡增加。NF-κB圈套核苷酸同樣抑制小梁細(xì)胞的增殖及DNA合成

9、,并且促進(jìn)小梁細(xì)胞凋亡的增加。 P65高表達(dá)促進(jìn)小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3mRNA的表達(dá),對MMP-2及TIMP-1,TIMP-2的表達(dá)無影響。NF-κB圈套核苷酸抑制小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3mRNA的表達(dá),對MMP-2及TIMP-1,TIMP-2的表達(dá)無影響。 P65高表達(dá)抑制小梁細(xì)胞TIGR基因mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá),NF-κB圈套核苷酸促進(jìn)小梁細(xì)胞TIGR基因mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)論:

10、 P65促進(jìn)小梁細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)TNF-α,提示NF-κB過度活化可引發(fā)小梁細(xì)胞出現(xiàn)過度炎癥反應(yīng)。 P65在小梁細(xì)胞中的過度表達(dá)抑制小梁細(xì)胞的增殖及DNA合成,并且促進(jìn)小梁細(xì)胞凋亡的發(fā)生。提示前房過度炎癥反應(yīng)可能影響小梁細(xì)胞的存活,炎癥繼發(fā)性青光眼的發(fā)生可能與NF-κB過度活化密切相關(guān)。 NF-κB圈套核苷酸抑制小梁細(xì)胞的增殖及DNA合成,并且促進(jìn)小梁細(xì)胞凋亡的發(fā)生,說明NF-κB在正常情況下具有維持小梁細(xì)胞數(shù)量及功能

11、平衡的作用。提示NF-κB活性過度受抑可能是糖皮質(zhì)激素性青光眼的發(fā)生機(jī)制之一。 NF-κB活化可促進(jìn)小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3的表達(dá),抑制NF-κB的活化則會抑制小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3的表達(dá),說明NF-κB在調(diào)控小粱網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)平衡機(jī)制中占有重要的地位。提示長期應(yīng)用NF-κB抑制劑,可能會導(dǎo)致小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3的分泌下降,造成小梁網(wǎng)ECM的過度堆積。 NF-κB的活化和抑制可促使小梁細(xì)胞TIGR基

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