雞毒支原體S6株P(guān)25、P33蛋白粘附特性的研究.pdf

1、雞毒支原體（MG）能夠引起雞慢性呼吸道疾?。–RD）與火雞傳染性竇炎，其感染給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　雞毒支原體（MG）缺乏典型細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，主要通過表面粘附蛋白來粘附、侵染宿主細(xì)胞。粘附蛋白是雞毒支原體定植于宿主細(xì)胞表面的關(guān)鍵因子，其在MG致病過程中發(fā)揮著重要作用。并且粘附蛋白可作為潛在的診斷用抗原，其在雞毒支原體感染的診斷應(yīng)用過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究依據(jù)生物信息學(xué)軟件對(duì)MG S6株基因組全部序列的分析，選取了

2、一個(gè)675bp的假定膜蛋白基因p25與915bp的假定粘附蛋白基因p33，重點(diǎn)研究它們可能具有的的粘附特性，為MG S6株診斷用抗原的篩選奠定基礎(chǔ)。
　　本研究通過定點(diǎn)突變分別獲得了可以體外表達(dá)的p25與p33基因，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)分別獲得了可溶性表達(dá)的P25與P33重組蛋白即（rP25與rP33），然后用純化后的重組蛋白分別免疫兔子制備rP25與rP33抗血清。分別利用rP25與rP33抗血清對(duì)MG S6株及雞滑液囊支原體（M

3、S）進(jìn)行鑒別，western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rP25與rP33抗血清能將二者鑒別開，因而推斷P25與P33可作為潛在的診斷用抗原。同時(shí)分別提取MG膜蛋白與漿蛋白組分，western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P25與P33均在MG S6株的胞膜與胞漿中有分布。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，rP25與rP33均能像MG S6一樣可以明顯粘附到雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-1細(xì)胞）上。而夾心ELISA檢測(cè)結(jié)果則表明rP25及rP33對(duì)DF-1細(xì)

4、胞的粘附為特異性粘附，其中兔抗rP25與rP33血清可以明顯抑制MG S6對(duì)DF-1細(xì)胞的粘附作用。流式細(xì)胞儀與透射電鏡檢測(cè)結(jié)果也同樣顯示，兔抗rP25與rP33血清能夠明顯抑制MG S6對(duì)DF-1細(xì)胞的粘附，并且兔抗rP25與rP33血清聯(lián)合作用抑制MG S6對(duì)DF-1細(xì)胞的粘附效果也很顯著。從而證明P25與P33均是MG的粘附相關(guān)蛋白，并可作為潛在的診斷用抗原，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　為了研究P25與P33粘附到宿主細(xì)

5、胞上是否能引起相關(guān)的免疫反應(yīng)，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β以及IFN-γ的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)釋放情況。結(jié)果均顯示rP25及rP33刺激DF-1細(xì)胞后相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄及釋放量與對(duì)照相比均不同程度的升高，從而證明P25與P33可作為潛在的免疫保護(hù)性抗原。
　　綜上，證明了P25與P33為雞毒支原體S6株的粘附相關(guān)蛋白，并可作為潛在的診斷用抗原；同時(shí)也證明了P25與P33