CTV p20和p23基因原核表達(dá)及不同分離株中p25蛋白與病毒含量分析.pdf

1、柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病是一種具有經(jīng)濟(jì)重要性的病害，廣泛分布于世界各柑桔產(chǎn)區(qū)，對(duì)全世界的柑桔產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。CTV是長(zhǎng)線形病毒屬（Closterovirus）正義單鏈RNA（+ssRNA）病毒，具有12個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)，可以編碼19種以上的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。CTV經(jīng)橘蚜以非循回半持久方式傳播。本研究構(gòu)建基因20和p23的原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)蛋白p20和p23。應(yīng)用大外殼

2、蛋白p25的多克隆抗體，使用ELISA方法分析不同蚜蟲(chóng)傳毒率CTV分離株中蛋白含量，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量分析不同毒源中病毒粒子相對(duì)含量，利用薄膜飼喂法使蚜蟲(chóng)獲得重組蛋白p20、p25和p27并在毒源植株上獲毒，分析蚜蟲(chóng)獲毒量及傳毒率的差異。本研究為CTV的流行病學(xué)、蚜傳機(jī)制、蚜蟲(chóng)-CTV-寄主相互作用的研究提供了基礎(chǔ)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)pET28a和pET22b多克隆位點(diǎn)及p20和p23核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，

3、進(jìn)行基因克隆并測(cè)序，測(cè)序準(zhǔn)確的單克隆經(jīng)酶切連接后轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)p20和p23融合蛋白。
　　2.應(yīng)用p25多克隆抗體，使用ELISA方法分析不同蚜蟲(chóng)傳毒率CTV分離株中蛋白含量，以毒源CT11A、CT14A、CT16-2、CT77和CT立間的葉片為樣品，陰陽(yáng)結(jié)果OD405的比值分別為2.7246、1.6607、1.1093、0.8508、0.8366，表明p25蛋白含量在毒源CT11A、CT14A、CT16-2

4、、CT77和CT立間中依次遞減。
　　3.應(yīng)用相對(duì)RT-qPCR分析不同毒源中病毒粒子含量，結(jié)果表明CTV不同分離株系CT11A、CT14A和CT16-2的病毒粒子含量依次遞減，但毒源中病毒粒子含量與蚜蟲(chóng)傳毒能力高低不完全一致，這表明病毒濃度是影響傳毒率的因素之一，可能其它因素也影響CTV的蚜蟲(chóng)傳播。
　　4.在褐色橘蚜人工飼料中添加原核表達(dá)的重組蛋白p25、p27和p20，蚜蟲(chóng)再獲毒CT11A、CT16-2和CT立間，應(yīng)用