基因沉默抑制子P1-HC-Pro和P25在瞬時體系中的作用.pdf

1、轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)是一種序列特異性的RNA降解過程，主要作用于同源性較高的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，也稱為RNA沉默(RNA silencing)。它廣泛存在于各種生物中，在植物中稱共抑制(cosuppression)、動物中稱為RNA干擾(RNA interference，RNAi)、真菌中被稱為RNA壓制(RNA quelling)。這種機(jī)制能夠識別并抑制入侵的外源DN

2、A，具有維持基因組穩(wěn)定表達(dá)的重要功能，也是植物抵御病毒入侵的主要途徑。與此對應(yīng)，對病毒侵染過程的研究發(fā)現(xiàn)，一些植物病毒也能夠編碼特定的蛋白質(zhì)來抑制植物的基因沉默反應(yīng)，即通過對PTGS抑制來對抗植物病毒的防御系統(tǒng)?；虺聊种谱覲1/HC-Pro包括煙草蝕刻病毒基因組RNA編碼蛋白P1的5’′端區(qū)域，HC-Pro蛋白以及蛋白P3的一小部分。由HC-Pro(由馬鈴薯Y病毒、煙草蝕刻病毒和蕪菁花葉病毒編碼)編碼序列的單獨表達(dá)也足夠抑制由病毒介

3、導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)，HC-Pro作用于轉(zhuǎn)錄后基因沉默的持續(xù)階段?；虺聊种谱覲25是馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)編碼的25kDa蛋白，P25作用于基因沉默的信號階段，這一階段包括基因信號的產(chǎn)生、傳遞和由信號介導(dǎo)的基因沉默。近年來，除了HC-Pro和P25病毒沉默抑制子外，已經(jīng)相繼鑒定出了20多種RNA沉默的病毒抑制子。對這些抑制子的研究，將有助于加

4、深人們對真核生物基因表達(dá)的理解，還可以豐富基因工程的研究理論。 本論文選取三種植物材料：本生煙草(N.benthamiana)、轉(zhuǎn)GFP的煙草(N.benthamiana(line 16c))和轉(zhuǎn)HC-Pro的煙草(N. benthamiana(line ab34))，建立了基于雙元載體的瞬時沉默系統(tǒng)和病毒載體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默系統(tǒng)，并研究了基因沉默抑制子P1/HC-Pro和P25在該體系的部分功能。 1．成功建立了基于

5、雙元載體的瞬時沉默體系。這套沉默系統(tǒng)相對于病毒侵染法而言具有快速而且不受實驗材料限制的特點，相對于基因槍轟擊法而言具有更節(jié)約實驗成本的特點。因此這套沉默可以用作其他基因沉默抑制子的鑒定和基因功能的研究。 2．基因沉默抑制子P1/HC-Pro在瞬時體系中提高了GFP的表達(dá)量。因此本文為增強(qiáng)異源蛋白在植物體內(nèi)表達(dá)的研究提供了一個新的策略，即基因沉默抑制子與目的基因的共表達(dá)，這對利用植物生物反應(yīng)器表達(dá)重要經(jīng)濟(jì)價值的異源蛋白以便于進(jìn)行商

6、業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。 3．成功制備了Rubisco大小亞基多克隆抗體，并將Rubisco小亞基多克隆抗體應(yīng)用于rbcS基因沉默的檢測。本論文提到的多克隆抗體的制備方法具有省時、成本低、特異性強(qiáng)等特點。 4．建立和優(yōu)化了病毒誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默系統(tǒng)，確定了病毒誘導(dǎo)基因沉默瞬時表達(dá)體系中煙草最佳侵染時期為4葉期和用于侵染的重組農(nóng)桿菌的濃度為OD值為0.6-1.5。 5．P25并不能影響GFP轉(zhuǎn)基因位點的甲基化，說明P