抑肽酶對凝血酶誘導的體外星形膠質(zhì)細胞凋亡性損傷的保護作用研究.pdf

1、目的:出血后腦細胞損傷是顱內(nèi)出血患者常見的致殘和致死原因.研究發(fā)現(xiàn)出血后腦細胞的損傷可能與血凝塊形成過程中產(chǎn)生的大量凝血酶有關(guān).凝血酶是參與凝血過程中"瀑布反應"的關(guān)鍵酶,也是一種多功能的絲氨酸蛋白酶.在腦的星形膠質(zhì)細胞上存在大量的凝血酶激活受體——蛋白酶激活受體(PARs),凝血酶可能通過PARs介導了星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生凋亡性損傷反應.抑肽酶是一種從牛肺組織中提取的天然絲氨酸蛋白酶抑制劑,前期研究發(fā)現(xiàn),抑肽酶對PARs活化誘導的細胞生物

2、學效應有調(diào)理作用,而其對凝血酶誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷是否有保護性作用尚未明確.該實驗以體外培養(yǎng)小鼠原代星形膠質(zhì)細胞為對象,比較研究了抑肽酶不同劑量預處理對凝血酶誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷的影響,并初步探討其可能的機制.材料和方法:出生24h內(nèi)的同窩健康昆明小鼠,分離大腦皮層并進行星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng),經(jīng)純化后純度達到95﹪以上者用于實驗.實驗分兩部分:1.凝血酶劑量依賴實驗組(T組):比較凝血酶不同劑量對星形膠質(zhì)細胞的影響,分為五個劑量進行:C

3、(空白培養(yǎng)基對照組),T10(凝血酶10U/ml),T20(凝血酶20U/ml),T50(凝血酶50U/ml),T100(凝血酶100U/ml);2.抑肽酶預處理實驗組(A組):探討抑肽酶不同劑量預處理對凝血酶100U/ml致星形膠質(zhì)細胞損傷的保護作用,分為六個劑量進行:C(等量培養(yǎng)基對照組),A0(抑肽酶0KIU/ml預處理),A100(抑肽酶100KIU/ml預處理),A300(抑肽酶300KIU/ml預處理),A500(抑肽酶50

4、0KIU/ml預處理),A700(抑肽酶700KIU/ml預處理).流式細胞儀和AO-EB染色法檢測細胞凋亡,免疫細胞化學檢測細胞凋亡相關(guān)基因的表達,彗星電泳檢測細胞的DNA損傷,測定培養(yǎng)基內(nèi)LDH了解細胞膜通透性改變,采用改良的考馬斯亮蘭R-250染色觀察細胞骨架蛋白的形態(tài)變化.最后,透射電鏡觀察抑肽酶預處理對星形膠質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)的影響.結(jié)果及結(jié)論:實驗發(fā)現(xiàn):1.經(jīng)過分離純化培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細胞生長狀態(tài)良好,經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白 (

5、glial fibrillary acidic protein,GFAP)鑒定,純度達到95﹪以上者用于實驗.2.凝血酶作用于星形膠質(zhì)細胞后引起細胞發(fā)生明顯的突起回縮、細胞間的極性消失并聚集成團,部分細胞核濃縮、染色質(zhì)邊集.劑量越大,改變越早越嚴重.抑肽酶預處理能明顯減輕這種反應,但即使A700也不能完全抑制這種反應.3.經(jīng)流式細胞儀檢測,凝血酶作用于星形膠質(zhì)細胞后,細胞凋亡率隨著凝血酶濃度的增大而升高;抑肽酶可顯著降低凝血酶誘導的星形

6、膠質(zhì)細胞凋亡率,但隨著劑量的增大,凋亡率的差別逐漸變小.4.AO-EB染色發(fā)現(xiàn),T組細胞核周圍出現(xiàn)分布不均的黃色亮點,隨凝血酶劑量增加,黃色亮點逐漸增多增強.抑肽酶預處理后可見細胞形態(tài)改變有一定程度的緩解,細胞核周圍黃色亮點明顯減少,細胞叢集現(xiàn)象也有明顯改善.5.凋亡相關(guān)基因免疫細胞化學顯示,抑肽酶對凝血酶誘導的Bcl-2蛋白表達抑制沒有明顯的干預作用,而對凝血酶誘導的即刻早期基因—c-fos和c-jun表達增強有顯著的促進作用.6.彗

7、星電泳發(fā)現(xiàn),凝血酶引起星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生典型的DNA"慧尾",隨著凝血酶劑量的增加,慧尾的長度和寬度也隨之增加,抑肽酶預處理后慧尾明顯變窄、變短.7.自動生化分析儀測定細胞培養(yǎng)基內(nèi)的LDH結(jié)果顯示,與C組相比,A0組星形膠質(zhì)細胞內(nèi)大量LDH滲漏,抑肽酶預處理能明顯減輕LDH的外滲,但抑肽酶各劑量組間無顯著性差異.8.采用改良的考馬斯亮蘭R-250染色方法進行細胞骨架蛋白染色,高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn),正常細胞的骨架蛋白排列致密,條理清晰,而T組中

8、發(fā)生突起回縮變圓的細胞骨架蛋白明顯稀疏,發(fā)生不同程度的空洞樣改變,抑肽酶預處理使發(fā)生形態(tài)改變的細胞數(shù)量明顯減少,但少數(shù)已發(fā)生形態(tài)改變的細胞骨架蛋白染色改變同T組.9.透射電鏡下,凝血酶100U/ml作用24h后的細胞出現(xiàn)明顯的損傷,主要表現(xiàn)為線粒體腫脹,染色質(zhì)邊集,部分成"新月"樣改變,細胞整體呈現(xiàn)凋亡早期表現(xiàn).抑肽酶預處理使線粒體腫脹減輕,多個視野均未見凋亡小體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯,細胞內(nèi)可見大量的尼氏體,細胞處于退化狀態(tài).由以上實驗結(jié)果

9、可以得出以下結(jié)論:1. 大劑量凝血酶改變了星形膠質(zhì)細胞內(nèi)c-fos、c-jun以及Bcl-2基因的表達,而抑肽酶對這些基因的表達有不同程度的影響.2. 抑肽酶對凝血酶誘導的星形膠質(zhì)細胞細胞膜、細胞骨架蛋白和DNA損傷有明顯的抑制作用,但不能完全抑制.3. 抑肽酶可以減輕凝血酶引起的細胞形態(tài)改變和超微結(jié)構(gòu)損傷,但不能抑制細胞的退化.4. 大劑量凝血酶作用后可以引起明顯的星形膠質(zhì)細胞凋亡,凋亡程度與劑量呈正相關(guān),而小劑量的抑肽酶即可對其顯著