土槿乙酸改善ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究：循環(huán)及斑塊內(nèi)單核吞噬細(xì)胞的變化及其潛在機(jī)制.pdf

1、目的和意義：動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, As）是心腦血管疾病的基礎(chǔ)病變，由粥樣斑塊導(dǎo)致血管重塑所引起相應(yīng)部位的缺血和出血事件，是全世界致殘、致死的重要病因。慢性炎癥和脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)是廣大學(xué)者公認(rèn)的AS的發(fā)病機(jī)制，單核/巨噬細(xì)胞系作為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要防線(xiàn)，參與了機(jī)體慢性炎癥和斑塊內(nèi)脂質(zhì)代謝的過(guò)程，其動(dòng)態(tài)變化在A(yíng)S發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。土槿乙酸（pseudolaric acid-B, PB）是一種藥理作用很

2、豐富的中藥提取物，目前已發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤、抗生育、抗血管生成和抗真菌的作用。本人所在研究團(tuán)隊(duì)的前期工作顯示PB可以激活單核細(xì)胞表面過(guò)氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor, PPAR），且有研究表明PPAR能夠參與炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝的過(guò)程。因此，我們提出以下假說(shuō)，PB通過(guò)調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞系的變化參與慢性炎癥和斑塊內(nèi)脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　研究方法，

3、第一部分：以8周齡雄性ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠作為研究對(duì)象，高脂飲食喂養(yǎng)8周形成AS后，隨機(jī)分為基線(xiàn)組(n=7)、高脂飲食組(n=7)、PB+高脂飲食組(n=7)、正常飲食組(n=7)和PB+正常飲食組(n=7)?；€(xiàn)組直接取材，其它各組干預(yù)4周后取材。進(jìn)行如下檢測(cè)：（1）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組外周血單核細(xì)胞亞群（Ly6Chi:Ly6G-CD11b+Ly6Chi, Ly6Clo:Ly6G-CD11b+Ly6Clo）比例的變化；

4、（2）免疫熒光染色檢測(cè)主動(dòng)脈根部增殖巨噬細(xì)胞；（3）油紅O染色檢測(cè)主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部AS斑塊負(fù)荷的面積；（4）酶聯(lián)免疫分析（Enzyme linked immune sorbent assay, ELISA）法檢測(cè)血漿中甘油三酯和總膽固醇的水平。第二部分：以RAW264.7（小鼠巨噬細(xì)胞系）為研究對(duì)象，含有熒光素標(biāo)記的氧化型低密度脂蛋白（fluorescence Dil-labeled oxidized low density

5、 lipoprotein, Dil-ox-LDL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，分為模型組、PB組和PB+GW966.2（PPARγ阻斷劑）組，每組3個(gè)樣本，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Dil-ox-LDL的熒光強(qiáng)度。含有氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)后形成泡沫細(xì)胞，分為模型組、PB組和PB+GW966.2（PPARγ阻斷劑）組，每

6、組3個(gè)樣本，進(jìn)行如下檢測(cè):（1）油紅O染色檢測(cè)泡沫細(xì)胞形成；（2）Real-time PCR檢測(cè)PB對(duì)PPARγ、肝X受體（liver X receptors, LXR）、ATP-結(jié)合盒（ATP-binding cassette transporter1, ABC1）和CD36基因表達(dá)量的影響。
　　研究成果：動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)（1）PB+高脂飲食組有降低Ly6Chi單核細(xì)胞亞群的趨勢(shì)，正常飲食組和PB+正常飲食組降低Ly6Chi單核細(xì)

7、胞亞群的比例；（2）PB+高脂飲食組有降低斑塊內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞的密度的趨勢(shì)，正常飲食組和PB+正常飲食組降低斑塊內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞的密度；（3）PB+高脂飲食組有降低血漿總膽固醇和甘油三酯水平的趨勢(shì)，正常飲食組和PB+正常飲食組降低血漿總膽固醇、甘油三酯的水平；（4）PB+高脂飲食組和正常飲食組均有降低主動(dòng)脈根部、頸總動(dòng)脈和主動(dòng)脈的斑塊負(fù)荷的趨勢(shì)，PB+正常飲食組降低主動(dòng)脈根部、頸總動(dòng)脈和主動(dòng)脈的斑塊負(fù)荷。細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)（1）PB降低巨噬細(xì)胞內(nèi)

8、Dil-ox-LDL的熒光強(qiáng)度；（2）PB能降低泡沫細(xì)胞內(nèi)PPARγ、LXRα和ABC1的表達(dá)量。
　　結(jié)論及意義：1.高脂飲食可以升高 ApoE-/-小鼠體內(nèi)甘油三酯和總膽固醇水平，使Ly6Chi單核細(xì)胞亞型的比例、斑塊內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞的密度升高，促進(jìn) AS的形成。PB+高脂飲食組有降低脂質(zhì)、Ly6Chi比例、增殖巨噬細(xì)胞密度和斑塊負(fù)荷的趨勢(shì)。正常飲食組降低脂質(zhì)、Ly6Chi比例和增殖巨噬細(xì)胞密度，有降低斑塊負(fù)荷的趨勢(shì)。PB+正常