露水草HMGR基因的克隆分析及20-羥基蛻皮甾酮生物合成調(diào)控研究.pdf

1、20-羥基蛻皮甾酮(20-hydroxyecdysterone,20E)是露水草(Cyanotis arachnoidea C.B.Clarke)植株中的主要甾酮活性成分,它不僅被廣泛應(yīng)用于蠶桑業(yè),而且具有許多藥理活性,能夠有效促進哺乳動物多種組織和器官的核酸與蛋白質(zhì)的合成,促進糖代謝和脂類代謝,改善高血糖癥和高血脂癥,調(diào)節(jié)免疫功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng),改善和治療缺氧和缺血性腦損傷,因此受到了世界各地科學(xué)研究工作者的廣泛重視。然而,由于其結(jié)構(gòu)

2、復(fù)雜,化學(xué)合成不能用于商品生產(chǎn),其天然來源匱乏問題始終制約著該化合物在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)上的應(yīng)用。20E屬于植物甾酮類化合物,3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)被認為是甾酮合成中的關(guān)鍵限速酶,是細胞中類異戊二烯生物合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控點,所以研究HMGR對了解植物甾酮的生物合成及其調(diào)控具有重要的理論意義。
　　我們首先從露水草植株中克隆出露水

3、草HMGR基因(CaHMGR),其基因全長為2037bp,由91bp的5,非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)、1800bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF)以及146bp的3,非翻譯區(qū)組成。開放閱讀框編碼一條含有599個氨基酸的多肽,預(yù)測其等電點和分子量分別為7.25與64.0kDa。在NCBI數(shù)據(jù)庫上對CaHMGR進行檢索比對,我們發(fā)現(xiàn)CaHMGR與已報道的許多其他植物的HMGR的氨基

4、酸序列十分相似。對推導(dǎo)出的多肽序列進行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其含有兩個3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-CoA)的結(jié)合域(ELPIGFVQLP和TTEGCLVA)和兩個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的結(jié)合域(DAMGMNM和GTVGGGT)。通過利用Swiss-Modeling對CaHMGR進行基于同源性的三級結(jié)構(gòu)模型分析,結(jié)果表明CaHMGR蛋白具有錯綜復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),其催化結(jié)構(gòu)域包括L-結(jié)構(gòu)域、N-結(jié)構(gòu)域和S-結(jié)構(gòu)域,與其

5、他植物的HMGR的結(jié)構(gòu)域十分相似。這暗示CaHMGR與其他植物的HMGR存在一定的催化相似性,而且CaHMGR是一個有功能的還原酶。根據(jù)CaHMGR及其他植物、真菌、昆蟲及動物的HMGR構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,結(jié)果表明HMGR都來自于一個共同的祖先并且逐漸進化成四個分支,其中CaHMGR屬于植物HMGR這一分支,與陽春砂HMGR的親緣關(guān)系最為接近。這些都說明CaHMGR屬于植物HMGR超家族。
　　我們建立了CaHMGR的絕對熒光實時定量

6、PCR的檢測方法,并調(diào)查了茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)對CaHMGR表達模式的影響。我們設(shè)計了基因特異性引物CaHF和CaHR,熒光實時定量PCR的熔解曲線只有單個峰,特異性產(chǎn)物熔解曲線峰Tm為82.5℃,表明引物特異性良好。同時,我們將質(zhì)粒標準品10倍梯度稀釋成不同濃度為模板進行反應(yīng),根據(jù)獲得的Ct值及基因拷貝數(shù)擬合曲線,得到標準曲線方程為y=-3.1116x+37.05,曲線擬合度R2達到0.9974,說

7、明曲線線性關(guān)系良好,可用于準確的定量。計算獲得的熒光實時定量PCR的擴增效率為102.6％,同樣符合熒光實時定量PCR的要求。CaHMGR在根、莖及葉中都有表達,在各組織表達的情況各異,其中在莖中表達最高,其次為根,再次為葉。MeJA對CaHMGR有明顯的誘導(dǎo)上調(diào)作用。MeJA處理組根和葉中 HMGR的表達為對照組的兩倍左右,而莖中HMGR的表達與對照組相比沒有顯著性差異。以上結(jié)果表明,CaHMGR是一個誘導(dǎo)響應(yīng)型基因,可被誘導(dǎo)子如Me

8、JA有效誘導(dǎo)。
　　采用MeJA、酵母誘導(dǎo)子(yeast elicitor,YE)及硝酸銀(AgNO3)三種誘導(dǎo)子刺激露水草懸浮細胞培養(yǎng)體系,當(dāng)施加0.2mM MeJA處理懸浮細胞時,測得細胞中20E含量為80.95μg/g DW,為對照組的8倍,而AgNO3(25μM)處理組的含量為對照組的6倍,YE(100 mg/L)處理組的為對照組的2倍,說明這三種誘導(dǎo)子均能明顯提高懸浮細胞中的20E的含量,為采用大規(guī)模生物反應(yīng)器生產(chǎn)20E

9、提供基礎(chǔ)研究。采用之前建立的熒光實時定量PCR方法檢測露水草懸浮細胞中HMGR的表達水平,結(jié)果表明三種誘導(dǎo)子均能明顯提高CaHMGR的表達水平。我們的結(jié)果顯示CaHMGR可被誘導(dǎo)子誘導(dǎo)高表達從而更多的甲羥戊酸可被合成進入類異戊二烯生物合成途徑用以合成萜類或植物甾體化合物。
　　在本文中,我們首次從露水草中克隆出 HMGR基因,對其進行了生物信息學(xué)分析以及表達模式分析并調(diào)查了MeJA、YE及AgNO3三種誘導(dǎo)子對露水草懸浮細胞中20