蛻皮甾酮促進(jìn)人表皮干細(xì)胞增殖的初步研究.pdf

1、蛻皮甾酮（Ecdysterone，EDS）是蛻皮激素中最主要的兩種之一。蛻皮激素是調(diào)控昆蟲蛻皮過程的激素，最早為昆蟲學(xué)家所研究。它不僅存在于昆蟲蛻皮過程中，也存在于昆蟲的其他生理節(jié)律變化時(shí)期，在低等植物厥類、裸子植物、被子植物中等眾多植物類群中也有存在，并且其含量遠(yuǎn)高于昆蟲，在哺乳動(dòng)物甚至人類某種情況下也有發(fā)現(xiàn)。其對無脊椎動(dòng)物體，尤其對節(jié)肢動(dòng)物的生長發(fā)育、蛻皮和生殖發(fā)揮重要的作用。 蛻皮激素在脊椎動(dòng)物中也是必需的物質(zhì)。研究表明，

2、蛻皮激素能促進(jìn)核酸及蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)糖代謝、促進(jìn)脂肪代謝、調(diào)節(jié)基因表達(dá)、改善免疫功能、影響中樞神經(jīng)、心血管系統(tǒng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等，因此被認(rèn)為有“更生誘導(dǎo)物質(zhì)（revive inducer）”的作用。 在前期的研究中本課題組發(fā)現(xiàn)自制的以蛻皮甾酮為有效成為的軟膏能夠促進(jìn)兔全層皮膚創(chuàng)面愈合，表現(xiàn)為創(chuàng)面愈合率較高，愈合速度較快，愈合質(zhì)量較好，顯微鏡下表現(xiàn)為毛細(xì)血管密度較高，并根據(jù)創(chuàng)面愈合率繪制出量效分析曲線。創(chuàng)面愈合是機(jī)體通過自身的

3、再生能力，為恢復(fù)其表面的連續(xù)性和完整性、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所進(jìn)行的一系列修復(fù)活動(dòng)，主要包括肉芽組織增生、創(chuàng)面再上皮化及瘢痕形成與創(chuàng)面愈合改建等一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程。內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等細(xì)胞的增殖是形成肉芽組織的關(guān)鍵，因此也是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵。表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面再上皮化過程中是各層表皮細(xì)胞的源細(xì)胞，正常情況下表皮細(xì)胞的更新主要是由基底部的干細(xì)胞向上增殖分化來完成。結(jié)合創(chuàng)面再上皮化在創(chuàng)面愈合中的作用，我們推測蛻皮甾酮能促進(jìn)表皮干細(xì)胞的

4、增殖，該促進(jìn)作用是可能是其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制之一。此外，目前用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合的外用藥主要以抗炎、止血、保護(hù)創(chuàng)面為主，而對真正體現(xiàn)傷口愈合速度的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用較小。故我們設(shè)計(jì)本研究，旨在通過觀察蛻皮甾酮對人表皮干細(xì)胞增殖的影響，深入探討其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制，為本課題組在前期研究中發(fā)明的以蛻皮甾酮為主要有效成分的促愈乳膏應(yīng)用于臨床提供更深入的理論依據(jù)。 目的: 通過觀察蛻皮甾酮對人表皮干細(xì)胞增殖的影響，深入探討其促進(jìn)創(chuàng)面

5、愈合的機(jī)制，為我們在前期研究中發(fā)明的以蛻皮甾酮為主要有效成分的促愈乳膏應(yīng)用于臨床提供更深入的理論依據(jù)。 方法: 采用中性蛋白酶-Ⅳ型膠原黏附法分離正常人包皮表皮干細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測第3代細(xì)胞β1整合素、角蛋白19、角蛋白14、角蛋白10表達(dá)以鑒定表皮干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用第3代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分6組，5個(gè)處理組的細(xì)胞分別用蛻皮甾酮濃度為10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L的Epilife培養(yǎng)基

6、培養(yǎng)；同時(shí)對照組的細(xì)胞用不含有蛻皮甾酮的Epilife培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于蛻皮甾酮作用后1d、2d、3d、4d時(shí)用MTT（3-（4，5-二甲基-2噻唑）-2，5二苯基溴化四唑）法檢測酶標(biāo)儀上490nm下的吸光度，判定蛻皮甾酮對人表皮干細(xì)胞增殖的影響。另外，蛻皮甾酮作用4d時(shí)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測對照組和80mg/L組的細(xì)胞周期改變，計(jì)算增殖指數(shù)PI，PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100％（G0：靜止期；G1：DNA合

7、成前期；S：DNA合成期；G2：DNA合成后期；M：分裂期）。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)，吸光度值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，6個(gè)濃度組和4個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的差異采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行6×4析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，各組、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組間差異以LSD法行多重比較；G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞比例及增殖指數(shù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，各組間的差異用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independent-Samples T Te

8、st）。顯著性標(biāo)準(zhǔn)均為P=-0．05。 結(jié)果: 1.表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定; 原代分離的人表皮基底層干細(xì)胞貼壁生長，呈圓珠狀，孵育培養(yǎng)24 h后，貼壁細(xì)胞逐漸伸展形成鋪路石樣。細(xì)胞代謝速度緩慢，生長周期漫長。胞體呈圓形、圓梭形，核質(zhì)比大，胞核將胞漿擠向胞體的周緣。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示β1整合素、CK19、CK14為陽性，CK10為陰性。 2.蛻皮甾酮對人表皮干細(xì)胞增殖的影響; 培

9、養(yǎng)1d、2d時(shí)，40、80mg/L濃度組吸光度高于對照組（P<0．05），10、20、160mg/L濃度組吸光度與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）；培養(yǎng)3d、4d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組吸光度均高于對照組（P<0．05）；各時(shí)間點(diǎn)所檢測的吸光度值均以80mg/L時(shí)最高。 3.蛻皮甾酮對對照組和80mg/L組細(xì)胞的周期及增殖指數(shù)的影響; 對照組G0/G1期細(xì)胞比例高于對照組（P=0．000），而S、G2/M期細(xì)胞比例和增殖指數(shù)均