山藥基源植物分子鑒別體系建立與珠芽相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、山藥(Dioscorea.opposita Thunb.)是中國(guó)的傳統(tǒng)藥材，其基源植物為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea Linn.)植物薯蕷(D.opposita Thunb.在《Flora ofChina》中，已將其正名為D.polystachya Turcz.)，在其所有品種中又以鐵棍山藥(D.polystachya‘Tiegun’)為最佳，目前公認(rèn)的道地性產(chǎn)區(qū)為河南溫縣。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上山藥的基源植物存在

2、著三個(gè)亂象:薯蕷近緣種的冒充造成物種混亂、鐵棍山藥的冒充造成品種混亂以及非道地產(chǎn)區(qū)冒充河南溫縣鐵棍山藥所造成的產(chǎn)區(qū)混亂。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別對(duì)于山藥藥材及其基源植物難以鑒定，顯微鑒別需要較高的專業(yè)知識(shí)及復(fù)雜的操作技術(shù)，分子標(biāo)記的指紋圖譜等傳統(tǒng)分子鑒定方法操作繁瑣、花費(fèi)的成本較大，因此基于基源植物鑒定的山藥藥材需要一種簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的方法。本研究搜集了山藥基源植物薯蕷5個(gè)易混近緣種、14個(gè)薯蕷主要品種以及8個(gè)鐵棍山藥主產(chǎn)區(qū)的實(shí)驗(yàn)材料，分別在

3、物種、品種及區(qū)域特異性三個(gè)層面建立分子鑒別體系。
　　珠芽是薯蕷重要的營(yíng)養(yǎng)器官和無(wú)性繁殖器官，但目前未見(jiàn)對(duì)其發(fā)生的分子機(jī)理的相關(guān)研究。本研究通過(guò)對(duì)產(chǎn)生珠芽的鐵棍山藥同株著生和不著生珠芽的葉腋、不產(chǎn)生珠芽的花籽山藥的葉腋等3個(gè)組織，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，旨在發(fā)掘參與珠芽發(fā)生的基因。具體研究的內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)分子標(biāo)記對(duì)薯蕷及5

4、個(gè)近緣種的遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，物種之間遺傳多樣性十分豐富:所篩選出的21對(duì)能擴(kuò)增出清晰并呈現(xiàn)多態(tài)性條帶的引物組合總共擴(kuò)增產(chǎn)生了355條重復(fù)性好、清晰的譜帶，其中338條帶為多態(tài)性帶，占總擴(kuò)增條帶的95.27％;平均每對(duì)引物擴(kuò)增16.90條帶譜和16.10條多態(tài)性帶。對(duì)遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性總位點(diǎn)系數(shù)為Na為1.8963，有效位點(diǎn)系數(shù)Ne為1.7506。遺傳多樣性指數(shù)H為0.4840，香農(nóng)指數(shù)Ⅰ為0.6662。6個(gè)物種的總的雜合度H

5、t為0.4541，物種內(nèi)的平均雜合度Hs為0.1661。物種間的Gst為0.5711，表明所有遺傳變異中的57.11％都出現(xiàn)在物種之間。物種之間存在較為豐富的基因交流(Nm=0.3754)的主要原因是野生薯蕷屬物種之間存在有性繁殖的方式。對(duì)物種之間的遺傳結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，日本薯蕷(D.japonica Thunb.)的Fis值最低，表明其種內(nèi)分化程度最高，褐苞薯蕷(D.persimilis Prain&Burkill)的種內(nèi)分化程度最低，山

6、薯(D.fordii Prain&Burkill)與其他5個(gè)物種的遺傳差異最大(Fst=0.155)，薯蕷與其它5個(gè)物種之間的遺傳差異最小(Fst=0.038)。對(duì)遺傳關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷與日本薯蕷之間遺傳關(guān)系最近。本研究結(jié)合SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)標(biāo)記開(kāi)發(fā)的物種特異性鑒定SRAP-SCAR分子標(biāo)記，能有效的將薯蕷從其近緣種中鑒定出來(lái)。
　　(2)利用ISAP(In

7、tron Sequence Amplified Polymorphism)分子標(biāo)記對(duì)薯蕷14個(gè)品種進(jìn)行了遺傳關(guān)系的分析，結(jié)果表明:11對(duì)ISAP引物共擴(kuò)增出95條帶，其中91條(95.79％)為多態(tài)性帶。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示薯蕷品種之間存在著豐富的遺傳多樣性:總位點(diǎn)系數(shù)Na變化范圍為1.8999到2.000，平均值為1.9651。有效位點(diǎn)Ne變化范圍為1.1529到1.4271，平均值為1.3018。，遺傳多樣性指數(shù)H變化范圍為0.1

8、327到0.2673，平均值為0.2002。香農(nóng)指數(shù)Ⅰ變化范圍為0.2011到0.5832，平均值為0.3102。遺傳相似系數(shù)與遺傳距離分析結(jié)果表明，與鐵棍山藥遺傳關(guān)系由近到遠(yuǎn)的品種分別為:太谷山藥、糙山藥、麻山藥、安順山藥、無(wú)架雙胞山藥、細(xì)長(zhǎng)毛山藥、米山藥、華鎣山藥、花籽山藥、小白嘴山藥、粗牛腿山藥、九斤黃及白玉山藥。薯蕷品種遺傳關(guān)系分析表明，薯蕷品種之間可以明顯的分成兩大支，并且與形態(tài)學(xué)特征相關(guān)。從11對(duì)引物中篩選出1對(duì)鐵棍山藥的特

9、異性引物，擴(kuò)增得到1條大為435bp的特異性片段。對(duì)14個(gè)品種140個(gè)單株植物進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果顯示鐵棍山藥10個(gè)單株全部在435bp處出現(xiàn)SCAR特異帶，其他13個(gè)品種沒(méi)有出現(xiàn)此帶。因此本研究開(kāi)發(fā)的ISAP-SCAR標(biāo)記可以作為鐵棍山藥的特異分子標(biāo)記，用來(lái)鑒別鐵棍山藥。
　　(3)利用ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記對(duì)鐵棍山藥8個(gè)產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)品的遺傳多樣性特征進(jìn)行分析，結(jié)果表明:遺傳多樣性總位

10、點(diǎn)系數(shù)Na變化范圍從1.7789到2.0000，有效位點(diǎn)Ne變化范圍為1.0417到1.5503，遺傳多樣性指數(shù)H為0.0794到0.3751以及香農(nóng)指數(shù)Ⅰ變化范圍為0.1864到0.5388，表明了區(qū)域之間存在較為豐富的遺傳多樣性水平。對(duì)區(qū)域之間的遺傳關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，與河南溫縣產(chǎn)區(qū)遺傳關(guān)系由近到遠(yuǎn)的地區(qū)分別是江蘇徐州、山西太原、山東濟(jì)寧、湖南瀏陽(yáng)、河北滄州、四川南充和廣東東莞，產(chǎn)區(qū)間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近與引種年限有關(guān)。利用SCAR(Seque

11、nceCharacterized Amplified Region)技術(shù)進(jìn)行鐵棍山藥的區(qū)域特異性相關(guān)的分子鑒別研究，通過(guò)ISSR擴(kuò)增，在引物ISSR4(ACACACACACACACACC)的擴(kuò)增產(chǎn)物中獲得河南溫縣鐵棍山藥的特異性譜帶，再將這個(gè)條帶轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記并進(jìn)行單株檢測(cè)，結(jié)果表明與河南溫縣鐵棍山藥的ISSR-SCAR標(biāo)記在廣東東莞、山東濟(jì)寧、四川南充、湖南瀏陽(yáng)、山西太原產(chǎn)區(qū)中未出現(xiàn)，證明與這個(gè)標(biāo)記能準(zhǔn)確鑒別引種時(shí)間較長(zhǎng)的非道地產(chǎn)

12、區(qū)的鐵棍山藥。
　　利用三種分子標(biāo)記的數(shù)據(jù)對(duì)薯蕷不同區(qū)域、不同品種及不同物種進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，薯蕷及其近緣種在系統(tǒng)樹(shù)上的位置與單獨(dú)使用SRAP標(biāo)記的分析結(jié)果相似:與薯蕷遺傳關(guān)系由近到遠(yuǎn)的物種依次是日本薯蕷、參薯、無(wú)翅參薯、褐苞薯蕷和山薯。
　　(4)本研究通過(guò)對(duì)鐵棍山藥同株生成珠芽、不生成珠芽及花籽山藥不生成珠芽等3個(gè)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果為:共得到Unigene70480個(gè)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組的差異基因分析表明，鐵棍山藥不生成珠芽

13、的組織相對(duì)于生成珠芽的組織，共有6263個(gè)Urigene表達(dá)上調(diào)，有8929個(gè)Unigene表達(dá)下調(diào);鐵棍山藥生成珠芽的組織相對(duì)于花籽山藥，共有13026個(gè)Unigene表達(dá)上調(diào)，有11352個(gè)Unigene表達(dá)下調(diào)。鐵棍山藥生成珠芽的組織同時(shí)相對(duì)于其不生成珠芽的部分及花籽山藥共有2698個(gè)Unigene上調(diào)，4949個(gè)Unigene下調(diào)。將差異基因在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，最終得到這些Unigenes的注釋信息。依據(jù)已報(bào)道的調(diào)

14、控龍舌蘭(Agave tequilana Linn.)、臺(tái)閩苣苔(Titanotrichum oldhamii(Hemsley) Solereder)珠芽發(fā)生的關(guān)鍵基因，并結(jié)合調(diào)控植物側(cè)枝形成的關(guān)鍵基因等，最終選擇23個(gè)可能參與薯蕷珠芽發(fā)生的候選基因。此外，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的SSR(simple sequence repeats)位點(diǎn)分布特征開(kāi)發(fā)得到11102對(duì)SSR引物，為進(jìn)一步的薯蕷育種和遺傳圖譜構(gòu)建等工作提供更加豐富的標(biāo)記選擇