全肝生物支架體外循環(huán)灌注培養(yǎng)下細(xì)胞再植及免疫原性分析的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 對于終末期肝臟疾病，肝移植是目前唯一具有明確療效的治療手段，移植手術(shù)具有高度復(fù)雜性，高風(fēng)險(xiǎn)而且費(fèi)用極其昂貴。另一方面，供體短缺仍然是世界性的難題，供肝來源的難以解決就要求去尋找另一個(gè)可替代的治療方案.肝細(xì)胞移植對于肝病患者的治療提供了新的方向，數(shù)年來的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用證明了該方法的可行性，此方法的簡易性，對機(jī)體的低創(chuàng)傷性，都使它成為肝臟組織工程領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。但是，在肝細(xì)胞移植的應(yīng)用中，細(xì)胞活性的難以長期

2、維持導(dǎo)致較低的存活率和增殖率，較低的植入效率，以及氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供給問題都限制了該方法的應(yīng)用，同時(shí)由門靜脈循環(huán)植入肝細(xì)胞有可能導(dǎo)致細(xì)胞在受體肺部的栓塞以及門靜脈高壓等并發(fā)癥。
　　 生物人工肝的研究開展為肝臟功能的暫時(shí)性替代提出了新的研究方案，其中一些已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，生物人工肝主要是通過肝細(xì)胞與患者血漿或全血在生物反應(yīng)器中的相互作用，以此來替代衰竭肝臟的部分功能，它并不是肝臟移植的一個(gè)永久性的替代解決方案，實(shí)現(xiàn)肝臟功能

3、的部分替代還亟待進(jìn)一步改進(jìn)。
　　 組織工程領(lǐng)域，通過去細(xì)胞化技術(shù)制得完整三維支架的方法成為了生物支架制備工藝的一個(gè)顯著突破。實(shí)質(zhì)器官中完整細(xì)胞外基質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)性和功能性分子因其構(gòu)成的復(fù)雜性，在實(shí)驗(yàn)中尚不能完全合成，細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原纖維、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等成分可被分離并促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化，完整的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的制備在一系列組織器官的重塑應(yīng)用中得到了充分的證實(shí)。截止目前，細(xì)胞外基質(zhì)成分在促進(jìn)結(jié)構(gòu)重塑中的分子機(jī)制并未完

4、全闡明，但是其表現(xiàn)出明確的生物誘導(dǎo)特性，而細(xì)胞外基質(zhì)所具有的生物相容性、機(jī)械力學(xué)特性以及降解特性都不足以單獨(dú)對其作出解釋。細(xì)胞外基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)性和功能性分子都由組織和器官中的原宿主細(xì)胞合成和分泌，因此其在不同的組織器官中的構(gòu)成和分布都具有特異性，同時(shí)決定了細(xì)胞外基質(zhì)作為組織和結(jié)構(gòu)重塑的理想底物支架。
　　 實(shí)質(zhì)器官具有復(fù)雜的脈管系統(tǒng)以及其構(gòu)建的毛細(xì)血管網(wǎng)有效地保證了所有的細(xì)胞分布都能獲得足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織和器

5、官的脫細(xì)胞過程相對來說難度是比較大的，這是因?yàn)槿ゼ?xì)胞洗滌劑難以通過傳統(tǒng)的去細(xì)胞化方法如機(jī)械攪拌的作用充分滲透到組織內(nèi)部，造成洗滌效果的降低。近來Ottetal則突破了傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌和滲透去細(xì)胞方法，創(chuàng)新性的采用了通過脈管結(jié)構(gòu)的動態(tài)灌注方法獲得了完整的小鼠去細(xì)胞化心臟支架，不僅保存了心臟的框架結(jié)構(gòu)以及完整的微脈管系統(tǒng)，同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了體外細(xì)胞再植。
　　 BasakEUygun通過改進(jìn)心臟灌洗方法，并將其應(yīng)用于肝臟生物支架的制備，在保

6、留肝臟特異性細(xì)胞外基質(zhì)成分的同時(shí)，完整保留了肝臟的脈管系統(tǒng)，為氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)和傳遞提供了重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近來，ThomasShupe與PedroM.Baptista等團(tuán)隊(duì)采用脈管系統(tǒng)插管，以循環(huán)灌注方法獲得了完整的肝臟生物支架。目前的肝臟生物支架的制備并沒有一個(gè)統(tǒng)一的流程，灌注通道不同，灌洗制劑種類不同，濃度不同，也造成了生物支架制備的所需時(shí)間不同，不同種類的洗滌劑對細(xì)胞外基質(zhì)微結(jié)構(gòu)的影響也不盡不同。
　　 本課題組在既往研

7、究工作中已成功制備去細(xì)胞化全肝支架。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化去細(xì)胞化大鼠肝臟的制作流程。通過離子型洗滌劑梯度濃度遞減法的應(yīng)用在完全洗脫細(xì)胞成分的基礎(chǔ)上，保留了大鼠肝臟組織的完整三維結(jié)構(gòu)和脈管系統(tǒng)，同時(shí)基本完整保留了肝臟組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分和生化特性，為進(jìn)一步研究去細(xì)胞化全肝生物支架在體外實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，本課題組自主設(shè)計(jì)了循環(huán)灌注培養(yǎng)裝置，通過觀察由門靜脈和下腔靜脈路徑植入的人源肝癌細(xì)胞系在支架中的粘附、增殖和功能表達(dá)情況，對去細(xì)胞化肝

8、臟生物支架復(fù)合系統(tǒng)的生物功能進(jìn)行評估，同時(shí)對該生物支架在異種生物體內(nèi)所具有的潛在免疫原性進(jìn)行了初步研究，為去細(xì)胞化技術(shù)在大型動物中的應(yīng)用，構(gòu)建可用于人體植入的人工肝臟進(jìn)行初步探索。
　　 第一章:去細(xì)胞化肝臟支架循環(huán)灌注培養(yǎng)條件下體外細(xì)胞再植
　　 目的:利用離子型洗滌劑梯度濃度遞減法制備全肝生物支架，并利用改良的循環(huán)灌注培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)生物支架的體外細(xì)胞再植，觀察人源肝癌細(xì)胞系在生物支架中的粘附，生長和功能表達(dá)狀況，為進(jìn)一

9、步的體外肝臟組織重建奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:首先經(jīng)門靜脈灌注含0.02％EDTA的D-Hanks，然后以1％TritonX100灌注，用時(shí)約一小時(shí)，500ml磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗肝臟，然后1％SDS/0.5％SDS/0.1％SDS各500ml依次灌洗，最后以磷酸鹽緩沖液(PBS)充分灌洗肝臟支架，灌注速度均為10ml/min。取另外新鮮肝臟樣本，取下腔靜脈路徑，灌注順序同上;觀察不同灌注路徑下的去細(xì)胞效果差異。將制備的

10、生物支架浸于PBS溶液中，4℃條件下保存。取約107個(gè)HepG2細(xì)胞，胰酶消化后配置成4ml的細(xì)胞懸液，取全肝生物支架保留中間葉(n=7)，結(jié)扎其余肝葉，其中2ml細(xì)胞懸液由門靜脈注入，2ml細(xì)胞懸液由肝上下腔靜脈注入，每次約5X106數(shù)量的細(xì)胞共分四次注入，每次操作間隔15分鐘，然后將支架置于孵箱環(huán)境中靜置4小時(shí)后開始循環(huán)灌注，每日更換培養(yǎng)基，同時(shí)取等量細(xì)胞平板培養(yǎng)作為對照組，每日更換培養(yǎng)基并留取樣本，通過測定循環(huán)液中白蛋白以及尿素含

11、量評估細(xì)胞功能;通過測定轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)觀察細(xì)胞存活狀況，繪制曲線觀察對比，分析在循環(huán)灌注培養(yǎng)過程中，實(shí)驗(yàn)組與對照組的白蛋白與尿素產(chǎn)量是否有顯著性差異，同時(shí)對轉(zhuǎn)氨酶釋放量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用-x±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間比較采取析因分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果:利用去細(xì)胞化肝臟支架構(gòu)建的體外循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)共進(jìn)行了7次體外循環(huán)培養(yǎng)。其中共有1次培養(yǎng)過程中發(fā)生污染，主要原因可

12、能為在構(gòu)建體外循環(huán)裝置和培養(yǎng)換液過程中的操作不當(dāng)導(dǎo)致。在循環(huán)灌注培養(yǎng)期間，細(xì)胞在支架中粘附、增殖良好，白蛋白和尿素表達(dá)量高于平板對照組，而在轉(zhuǎn)氨酶的釋放方面，在循環(huán)灌注培養(yǎng)的前兩天中，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)氨酶含量要高于對照組，但是從第三天起，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)氨酶的釋放量逐步低于平板培養(yǎng)對照組。
　　 結(jié)論:通過離子型洗滌劑梯度濃度遞減法完整制備了全肝生物支架，實(shí)現(xiàn)了去細(xì)胞化方法的優(yōu)化。通過自行設(shè)計(jì)的循環(huán)灌注培養(yǎng)裝置，實(shí)現(xiàn)了人源性肝癌細(xì)胞系在異種去細(xì)

13、胞化肝臟生物支架中的再植，證明了我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可行性，為下一步通過去細(xì)胞化技術(shù)構(gòu)建可用于人體內(nèi)移植的人工肝臟探索基本的技術(shù)路線。
　　 第二章:去細(xì)胞化肝臟支架在異種生物體內(nèi)免疫原性分析
　　 目的:通過離子型洗滌劑梯度濃度遞減法制備去細(xì)胞化肝臟支架，探索去細(xì)胞化肝臟支架在異種生物體內(nèi)的免疫原性。
　　 方法:以SD大鼠作為研究對象，首先以離子型洗滌劑梯度濃度遞減法制備全肝生物支架，將紅色鑄型劑經(jīng)由脈管系統(tǒng)注入

14、觀察脈管系統(tǒng)保存是否完整，在完整支架中隨機(jī)取材，所取得的組織塊大小約1cm×1cm，將組織塊置于0.1％過乙酸溶液中，在37℃條件下置于搖床中以300RPM轉(zhuǎn)速持續(xù)3個(gè)小時(shí)。過乙酸溶液浸泡以后，將組織塊置于PBS中持續(xù)洗滌15分鐘，換液后置于PBS溶液中保存。在新西蘭大白兔(n=10)背部取約2cm切口，將組織塊包埋于背部肌肉中。操作過程中保持無菌原則，并予以術(shù)后每日換藥，縫合后連續(xù)三日給予青霉素輸注，早晚各一次，每次八萬單位。同時(shí)取同

15、批次同體重的新西蘭大白兔作為對照組(n=10)，單純?nèi)”巢壳锌谧鳛榧偈中g(shù)組。每日取血樣品送檢測量C反應(yīng)蛋白(CRP)和IgE.并于植入時(shí)間達(dá)兩周及四周時(shí)，分批取出植入組織塊，進(jìn)行組織學(xué)染色觀察。
　　 結(jié)果:組織塊植入的前五天中，每日取血樣本測定實(shí)驗(yàn)組以及假手術(shù)組中大白兔的C反應(yīng)蛋白（CRP）以及IgE的含量，可見:CRP未見明顯升高，IgE的含量極低，幾乎無法檢出，與對照組無明顯差異。分別于包埋期達(dá)到2周和4周的時(shí)間點(diǎn)，手術(shù)切

16、開實(shí)驗(yàn)組動物背部肌肉組織獲取植入組織樣本，取出的去細(xì)胞化大鼠肝臟組織外觀均呈現(xiàn)白色，質(zhì)地較柔軟，被周圍肌肉組織包裹，將組織塊取出后，以PBS液沖洗組織樣本表面殘留的血液，組織切片，HE染色結(jié)果提示植入組織未見明顯細(xì)胞浸潤;同時(shí)對2周以及4周包埋期組織塊切片行瑞氏染色，在組織塊植入時(shí)間達(dá)到2周時(shí)，植入肝臟組織與背部肌肉組織交界處仍有炎癥細(xì)胞浸潤，而當(dāng)植入時(shí)間達(dá)到4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)樣本與肌肉組織交界處結(jié)合良好，未觀察到明顯的細(xì)胞浸潤。同時(shí)對植入組