手術(shù)切除聯(lián)合ALA-PDT治療大鼠9L膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,占全部顱內(nèi)腫瘤的40％～50％,其中惡性膠質(zhì)瘤占腦膠質(zhì)瘤的60％。目前對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的治療多為臨床手術(shù),輔以術(shù)后的放療、化療。但腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞雖不向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,卻向正常腦組織浸潤(rùn)性生長(zhǎng),與正常組織分界不清,故此手術(shù)很難完全切除。殘存的腫瘤細(xì)胞會(huì)造成術(shù)后腫瘤再次復(fù)發(fā),從而嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存期。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前惡性膠質(zhì)瘤患者中位生存期僅為9～12個(gè)月。雖然術(shù)后的放療、化療可以有效地殺傷部分殘存的腫瘤細(xì)胞,但同時(shí)

2、亦會(huì)損傷正常腦組織,并會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的全身不良反應(yīng),治療效果不甚滿意。因此,積極探索有效地治療方法,尋求更佳的治療方案及有效地控制術(shù)后腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)將成為提高腦膠質(zhì)瘤治療效果的關(guān)鍵。
　　 光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)是一種新興的治療方法,其原理是利用光敏劑可特異性的聚集于腫瘤組織內(nèi)并可被特定波長(zhǎng)的光所激活,從而產(chǎn)生一系列有細(xì)胞毒性的活性分子,直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡,從而達(dá)到治療的目的。目前光動(dòng)力學(xué)療法已在多種腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究與臨床治療

3、當(dāng)中應(yīng)用,這些實(shí)驗(yàn)和探索已初步表明PDT是一種有效的腫瘤局部治療手段。
　　 目前,關(guān)于PDT治療腦瘤的相關(guān)報(bào)道并不多見,初步的臨床應(yīng)用表明PDT治療惡性腦膠質(zhì)瘤,可使腫瘤組織發(fā)生壞死,從而延長(zhǎng)惡性膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間,但多數(shù)患者最終還會(huì)因腫瘤復(fù)發(fā)而死亡。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究水平上,迄今為止,有關(guān)PDT治療腦膠質(zhì)瘤的研究多數(shù)是探討PDT治療后腫瘤及周圍腦組織的急性反應(yīng)(一般是在治療后的3天之內(nèi)),在此期間,PDT可使腫瘤組織發(fā)生壞死

4、和細(xì)胞凋亡。但PDT對(duì)膠質(zhì)瘤和正常腦組織的影響遠(yuǎn)不止于此,在PDT治療后的亞急性期,腫瘤及周圍腦組織會(huì)出現(xiàn)何種反應(yīng),對(duì)此人們對(duì)卻知之甚少,因此在評(píng)價(jià)PDT在腦膠質(zhì)瘤中的治療作用方面還有一些不足。
　　 本研究通過建立9L/Fischer344大鼠原位腦膠質(zhì)瘤模型,利用新型的光敏劑5-氨基乙酰丙酸(ALA),觀察ALA-PDT的治療效果并探討其治病機(jī)理;另外,我們還將研究在PDT照射后的亞急性期,膠質(zhì)瘤和正常腦組織對(duì)PDT的反應(yīng),

5、為正確的評(píng)價(jià)PDT在腦膠質(zhì)瘤中的治療作用提供完整的理論依據(jù);本研究還將積極探究有效地腦膠質(zhì)瘤治療方案,即利用顯微外科手術(shù)輔以術(shù)后ALA-PDT療法治療大鼠腦膠質(zhì)瘤,觀察其作用效果,并就其作用機(jī)理進(jìn)行深入探討,從而為臨床提供有效地治療方案,并提供實(shí)驗(yàn)、理論依據(jù)。本課題共分三部分進(jìn)行:
　　 第一部分采用立體定向技術(shù),在Fischer344大鼠右側(cè)額葉尾狀核接種經(jīng)體外培養(yǎng)、定量的9L細(xì)胞。接種后動(dòng)態(tài)觀察大鼠生存狀態(tài)及生存時(shí)間;利用H

6、.E.染色法定期觀測(cè)顱內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況及病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn);待動(dòng)物死亡后,解剖取腦,制作病理切片,再次觀察腫瘤的大小及組織的形態(tài)變化。另外,在建立大鼠9L腦膜瘤的基礎(chǔ)上,應(yīng)用神經(jīng)外科顯微技術(shù)近全切除大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤,建立了9L大鼠惡性腦膠質(zhì)瘤顯微切除模型。并觀察術(shù)后大鼠的生存狀態(tài)及生存時(shí)間;觀測(cè)顱內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)特點(diǎn);待動(dòng)物死亡后,再次觀察腫瘤的大小及組織的形態(tài)變化。而且通過免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)和中間絲蛋白(

7、Vimentin)在腦膠質(zhì)瘤及切除后復(fù)發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)情況。通過上述兩個(gè)模型的建立,為后續(xù)的腫瘤實(shí)驗(yàn)治療研究提供可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 第二部分利用新型的光敏劑5-氨基乙酰丙酸(ALA),觀察新的PDT治療手段(ALA-PDT)在PDT照射后的亞急性期的治療效果及探討其作用效果。32只大鼠顱內(nèi)種植9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞。24只接受PDT治療的荷瘤大鼠在種植后第7天,接受PDT治療前3h腹腔注射300 mg/kg的光敏劑ALA,并在

8、24小時(shí)后分別以40 J/cm2(8只),80 J/cm2(8只)和120 J/cm(只)的不同激光劑量進(jìn)行治療。其余8只大鼠作為對(duì)照組。觀察大鼠的一般生存狀態(tài);在腫瘤植入14天后,通過H.E.染色法檢測(cè)顱內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況,在對(duì)其作用機(jī)理的探討中,利用免疫組化法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖活性(Ki67)和TUNEL法測(cè)定腫瘤細(xì)胞的凋亡;另外本部分實(shí)驗(yàn)還將重點(diǎn)研究在PDT照射后的亞急性期,膠質(zhì)瘤和周圍相對(duì)正常的腦組織的反應(yīng),利用Westernbl

9、ot的方法分別檢測(cè)腫瘤區(qū)和腫瘤鄰近區(qū)域中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)情況。
　　 第三部分重點(diǎn)觀察顯微外科近全切除手術(shù)聯(lián)合ALA-PDT治療大鼠原位9L腦膠質(zhì)瘤的效果并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行探討。32只大鼠顱內(nèi)種植9L腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞7天后,隨機(jī)分為對(duì)照組(未治療)、手術(shù)組(近全切除顱內(nèi)腫瘤)、PDT組(ALA:300 mg/kg,能量密度:80 J/cm2)和聯(lián)合治療組(手術(shù)切除+PDT),并給

10、予相應(yīng)治療。治療后7天取出腦組織,利用H.E.染色檢測(cè)腫瘤體積及浸潤(rùn)瘤灶的情況,并分別通過免疫組化法和TUNEL染色法分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡的情況。
　　 結(jié)果:第一部分通過立體定向接種體外培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)成功建立了大鼠顱內(nèi)9L膠質(zhì)瘤模型。大鼠接種后的初期無明顯不良反應(yīng),隨著腫瘤的生長(zhǎng)而逐漸出現(xiàn)相應(yīng)的表現(xiàn),其過程符合臨床腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展過程。H.E.染色和免疫組化結(jié)果顯示9L細(xì)胞所引起的腦膠質(zhì)瘤具有該腫瘤的病理形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點(diǎn)

11、,并可在腫瘤周圍引起膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng),免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)顯示腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)特異性的蛋白Vimentin,周圍反應(yīng)性的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP。另外利用顯微外科技術(shù)成功建立了近全切除腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除模型。手術(shù)切除后在一段時(shí)期內(nèi)可提高大鼠的生存狀態(tài),延長(zhǎng)生存時(shí)間,但最終會(huì)因腫瘤復(fù)發(fā)而死亡。復(fù)發(fā)以后的腫瘤無論是在形態(tài)學(xué)還是在生物學(xué)方面都未發(fā)生明顯變化。
　　 第二部分利用新的光敏劑ALA,建立了新的PDT治療模式-ALA-PDT。不同劑

12、量的ALA-PDT治療后明顯改善由于腦膠質(zhì)瘤所引起的大鼠生存狀態(tài)的下降,并且減小腦膠質(zhì)瘤的體積,其治療效果在一定范圍內(nèi)隨著劑量的增大而增強(qiáng),但80和120J/cm2的治療效果基本相同。通過對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ALA-PDT的治療作用是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)的,對(duì)細(xì)胞的增殖沒有影響,因此殘存的處于增殖期的腫瘤細(xì)胞仍可成為治療后腫瘤復(fù)發(fā)的原因。另外在照射后的亞急性期,通過Westerb blot方法發(fā)現(xiàn)對(duì)照組及不同劑量的A

13、LA-PDT組中腫瘤組織內(nèi)的HIF-1α和VEGF的表達(dá)均很高,在腫瘤旁組織中,對(duì)照組的HIF-1α和VEGF略有表達(dá),隨著ALA-PDT治療劑量的療增高,HIF-1α和VEGF的表達(dá)也逐漸增高,有以120J/cm2的照射劑量作用最為顯著。
　　 第三部分與對(duì)照組相比,手術(shù)切除組、單獨(dú)ALA-PDT組和聯(lián)合治療組在治療7天后均可明顯縮小腦瘤體積(P＜0.01)。在3個(gè)治療組中,以聯(lián)合治療組的治療效果最佳,腦瘤體積比PDT組和手術(shù)

14、組分別減少約82％(P＜0.001)和54％(P＜0.01)。光鏡下觀察H.E.切片發(fā)現(xiàn),對(duì)照組和PDT組腫瘤體積大,無出血和壞死,腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),周圍有大量的大小不一的浸潤(rùn)灶。手術(shù)組和聯(lián)合治療組中的腫瘤絕大部分被切除,術(shù)后“殘腔”周圍有少量的腫瘤浸潤(rùn)灶,但聯(lián)合治療組中的浸潤(rùn)灶為邊界清楚的小圓形病灶,且數(shù)量極少,浸潤(rùn)瘤灶面積也最小。另外,3只聯(lián)合治療組的大鼠和2只手術(shù)組的大鼠在術(shù)后“殘腔”周圍有少量出血灶。TUNEL染色顯示手術(shù)組的陽(yáng)

15、性細(xì)胞和對(duì)照組相比無顯著性差異,但ALA-PDT組和聯(lián)合治療組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)卻明顯高于對(duì)照組,說明手術(shù)切除對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡無影響,但ALA-PDT和聯(lián)合治療卻可以明顯的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Ki67免疫組化染色表明Ki67指數(shù)在各組間比較無顯著性差異。
　　 結(jié)論:19L/Fischer344大鼠原位腦膠質(zhì)瘤模型良好地模擬了人顱內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展過程,具備該腫瘤的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性,模型成功。
　　 2運(yùn)用顯微外科技術(shù)近全切除

16、腦膠質(zhì)瘤可改善荷瘤大鼠的生存狀態(tài),延長(zhǎng)生存時(shí)間,但腫瘤仍可復(fù)發(fā)。
　　 3 ALA-PDT可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來減少腦膠質(zhì)瘤的體積,且無明顯不良反應(yīng)。但ALA-PDT在治療的同時(shí)可促進(jìn)腫瘤旁組織中的HIF-1α和VEGF的表達(dá)增高,從而促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā),影響治療效果。
　　 4近全手術(shù)切除顱內(nèi)腫瘤并聯(lián)合ALA-PDT治療明顯提高了腦膠質(zhì)瘤的治療效果,這與ALA-PDT促進(jìn)手術(shù)后殘存腫瘤細(xì)胞的凋亡,殺滅浸潤(rùn)的腫瘤病灶有關(guān)