2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景及目的: 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤之一,約占顱內(nèi)腫瘤的40%~60%,尤其是惡性腦膠質(zhì)瘤,具有遠處侵襲性,惡性程度高,目前在神經(jīng)外科手術(shù)技術(shù)、影像診斷技術(shù)、放療化療等方面盡管取得了很大的進步,但患者臨床治療效果仍不盡人意,治愈率低且易復(fù)發(fā),死亡率高,其主要原因之一是患者自身抗腫瘤免疫功能低下,如何提高患者抗腫瘤免疫機能是膠質(zhì)瘤治療研究中的主要問題之一。隨著對腦膠質(zhì)瘤免疫學(xué)特性的深入研究和生物技術(shù)的發(fā)展,探索

2、各種膠質(zhì)瘤主動免疫疫苗成為生物免疫治療中關(guān)注的熱點。當(dāng)前,治療性腦膠質(zhì)瘤疫苗主要有以下幾類:一是樹突狀細胞(dendritic cell,DC)為基礎(chǔ)的疫苗,二是腫瘤細胞的瘤苗,三是基于病毒載體的溶瘤疫苗。其中腫瘤細胞疫苗是目前主要的研究方向。 本課題研究的是大鼠白介素-12基因(rIL-12)和人類I型單純皰疹病毒胸苷激酶自殺基因(HSV-TK)共同修飾大鼠膠質(zhì)瘤9L細胞構(gòu)建的9L-rIL-12/TK可控性“活”細胞疫苗。此疫

3、苗細胞具有較完全的腫瘤細胞抗原表達,理論上具有提高免疫調(diào)節(jié)能力,同時更昔洛韋(GCV)對該疫苗具有殺傷作用,可以控制活疫苗的增殖,防止疫苗細胞在體內(nèi)持續(xù)增殖或種植轉(zhuǎn)移,在此殺傷過程中,可進一步增強腫瘤抗原的釋放和抗原提呈作用,進而達到持續(xù)提高膠質(zhì)瘤的免疫原性,克服因血腦屏障帶來的免疫逃避,強化誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。關(guān)于本課題提出的可控制性膠質(zhì)瘤疫苗模式,目前在國內(nèi)尚未見類似報告。 本研究通過對現(xiàn)有9L-rIL12-TK細胞體外純化

4、抗性篩選,觀察其增殖情況,同時對其進行GCV殺傷實驗,驗證HSV-TK/GCV系統(tǒng)的體外殺傷效應(yīng),在此基礎(chǔ)上進行裸鼠皮下細胞接種,觀察疫苗細胞的體內(nèi)成瘤情況并對其進行GCV干預(yù),對比干預(yù)前后活疫苗細胞成瘤變化,評估9L-rIL12-TK腦膠質(zhì)瘤基因免疫活細胞疫苗在體內(nèi)的安全可控性,為后續(xù)免疫研究打下基礎(chǔ)。 材料與方法: 1.實驗材料; 自主構(gòu)建基因修飾細胞(9L-rIL12-TK、9L-TK),9L大鼠腦膠質(zhì)瘤細

5、胞;高糖型DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清FCS,含0.2%(m/V)EDTA的消化胰酶,更昔洛韋GCV,四甲基偶氮唑藍MTT,二甲基亞砜(DMSO),BSD,G418,臺盤藍,一次性耗材,BABL/C裸鼠(SPF)等。 2.實驗方法; 2.1,體外細胞實驗; 2.1.1,細胞增殖觀察抗性篩選細胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L細胞24孔板培養(yǎng),每日消化一組,計數(shù)細胞,連續(xù)5天,觀察細胞增值穩(wěn)定性; 2.

6、1.2,細胞GCV殺傷實驗抗性篩選細胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L細胞96孔板培養(yǎng),次日更換0、5、10、20、40、80、160μg/ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng),每日觀察細胞生長情況,第4天MTT法測細胞活力; 2.2,體內(nèi)細胞成瘤抑制實驗 2.2.1,裸鼠成瘤實驗40只裸鼠隨機分為3組,9L-rIL12-TK、9L-TK及9L組,相應(yīng)細胞右側(cè)腋下接種,1.2×106/只; 2.2.2,成瘤干預(yù)實驗第7天三

7、組裸鼠每組二次分GCV實驗組及生理鹽水對照組,次日開始干預(yù),實驗組腹腔給予GCV抑瘤干預(yù),對照組給予生理鹽水以行對照; 2.2.3,觀察途徑定時測量瘤徑,記錄裸鼠生存時間,實驗終止時取相應(yīng)標(biāo)本組織學(xué)檢查。 實驗結(jié)果: 1.1,24孔板培養(yǎng)觀察到抗性克隆細胞呈對數(shù)穩(wěn)定增殖,細胞的種類與各時間點的交互效應(yīng)有顯著性差異(F=4.220,P=0.003),不同細胞生長差異有顯著性意義(F=8.761,P=0.017),不

8、同時間點細胞有顯著性差異(F=2316.347,P=0.000),其中第4天各細胞有顯著差異(P=0.005),其余時間點各細胞間無顯著差異(P>0.05); 1.2,通過含不同濃度的GCV的完全培養(yǎng)基96孔板細胞培養(yǎng),MTT法檢測細胞活力,可見含帶TK基因的細胞活力與GCV的濃度呈負相關(guān),不同濃度GCV與三種細胞活力的交互作用有顯著性差異(F=407.699,P=0.000),不同濃度的GCV對細胞活力的影響有顯著性差異(F=

9、2830.488,P=0.000),三種細胞對GCV敏感性有顯著性差異(F=6807.262,P=0.000),其中,在GCV濃度為10ug/ml時,9L-rIL12-TK及9L-TK細胞殺傷率分別為62.7%、50.93%,前者較后者敏感,差異顯著(P=0.000),而9L細胞基本不受影響,在濃度20-160ug/ml時,9L細胞和9L-TK、9L-rIL12-TK細胞間有顯著差異(均P=0.000),而9L-rIL12-TK細胞和9

10、L-TK細胞間無顯著性差異(均P>0.05),細胞基本完全被殺死,9L細胞僅有少量死亡; 2.1,疫苗細胞體內(nèi)成瘤抑制實驗9L-rIL12-TK疫苗細胞與9L-TK細胞、9L細胞接種裸鼠皮下,觀察到所有裸鼠在第7天均有成瘤,成瘤率100%,GCV干預(yù)后,9L-rIL12-TK、9L-TK實驗組裸鼠瘤體積均縮小,其余組瘤體繼續(xù)呈增大趨勢。取干預(yù)前后及實驗后期共四個時間點比較瘤體變化,不同時間點與不同組間裸鼠腫瘤體積增長的交互作用有

11、顯著性差異(F=47.004,P=0.000),不同時間點腫瘤體積增長有顯著性差異(F=316.600,P=0.000),不同組間裸鼠腫瘤體積增長有顯著性差異(F=60.442,P=0.000),其中干預(yù)開始即第9天不同組間腫瘤體積(200.025±38.46mm3)無顯著性差異(P=0.476),干預(yù)結(jié)束后即第18(273.61±256.47mm3)、27(1078.21±1287.79mm3)、36(4350.16±4289.69m

12、m3)天時,9L-rIL12-TK+GCV組和9L-rIL12-TK組比較差異均顯著(P=0.003、0.002、0.001),9L-TK+GCV組與9L-TK組差異也均顯著(P=0.004、0.001、0.006),9L實驗組和對照組比較差異不顯著(P>0.05),干預(yù)后不同時間點9L-rIL12-TK+GCV組和9L-TK+GCV組間無顯著性差異(P>0.05),裸鼠瘤體呈消退趨勢,其中9L-rIL12-TK+GCV組治療后細胞生長

13、受控(抑瘤率97.26%)較9L-TK+GCV組(抑瘤率82.52%)明顯,而9L組與9L+GCV組則無顯著差異(P>0.05),瘤體隨時間呈增大趨勢。60天時,腫瘤完全消退9L-rIL12-TK+GCV組有8只,復(fù)發(fā)率為0%,9L-TK+GCV組有3只腫瘤完全消退,5只縮小后再次增大,復(fù)發(fā)率62.5%。荷瘤裸鼠生存時間均受影響,9L+GCV組與9L組間無顯著性差異(LogRankX2=0.392,P=0.531),而9L-rIL12-

14、TK、9L-TK實驗組與相應(yīng)對照組間均有顯著差異(LogRankX2=15.782,LogRankX2=15.665,均P=0.000),裸鼠腫瘤消退或生長減慢,動物生存時間延長,尤其9L-rIL12-TK實驗組裸鼠完全無瘤生存。 2.2,裸鼠無瘤接種部位、瘤體及全身相關(guān)臟器取材,大體觀察,含帶rIL-12基因細胞的裸鼠脾臟顯著增大,9L-IK實驗組后期瘤結(jié)節(jié)中有大量液化壞死;組織學(xué)(蘇木精-伊紅染色HE)鏡下檢查,無瘤接種部位

15、無發(fā)現(xiàn)異性腫瘤細胞,瘤體中異型性細胞明顯,不含帶rIL-12基因的細胞瘤結(jié)節(jié)中血管豐富,而帶rIL-12基因的裸鼠脾臟淋巴細胞增多;所有裸鼠全身臟器病理學(xué)檢查均未見腫瘤遠處組織學(xué)轉(zhuǎn)移征象。 實驗結(jié)論: (1)基因修飾后的9L-rIL12-TK細胞體外增殖穩(wěn)定,對GCV殺傷效應(yīng)敏感,表明TK基因在疫苗細胞內(nèi)是穩(wěn)定表達; (2)9L-rIL12-TK細胞在裸鼠體內(nèi)可成瘤,但能夠被GCV抑制消除; (3)9L-

16、rIL12-TK細胞與9L-TK細胞均在裸鼠體內(nèi)成瘤,但GCV的抑瘤效果9L-rIL12-TK實驗組明顯優(yōu)于9L-TK實驗組,表明rIL-12參與調(diào)節(jié),從而提高消瘤效果; (4)9L-rIL12-TK組裸鼠脾臟顯著增大,組織學(xué)檢查淋巴細胞增多,提示rIL-12可能參與調(diào)節(jié)體液免疫,其機理有待進一步實驗研究; (5)9L-rIL12-TK細胞僅在局部成瘤,未見遠處轉(zhuǎn)移征象。 上述結(jié)論表明,9L-rIL12-TK細胞

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