提高化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)再生速度和修復(fù)長度的實驗研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷是臨床上的難題，目前依然以自體神經(jīng)移植修復(fù)為主要手段，但由于自體神經(jīng)來源有限且供區(qū)有較多并發(fā)癥，故多年來醫(yī)學(xué)界不斷尋找能替代自體神經(jīng)移植的生物材料。在眾多的替代材料中，去細(xì)胞異體神經(jīng)顯示了良好的應(yīng)用前景。化學(xué)法萃取去細(xì)胞異體神經(jīng)(Chemically ExtractedAcellular Nerve，CEAN)，在最大限度地去除免疫原性物質(zhì)的同時，較好地保存神經(jīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的活性成分，成為修復(fù)周圍神經(jīng)缺損理想材料之一

2、。
　　 在我們前期的研究中，已經(jīng)采用CEAN成功地修復(fù)了犬、猴的大段周圍神經(jīng)缺損，取得了良好效果，其有效修復(fù)長度范圍可達(dá)8厘米。應(yīng)用CEAN橋接周圍神經(jīng)損傷傷后，在再生神經(jīng)纖維長入靶器官之前，患側(cè)肌肉已發(fā)生嚴(yán)重萎縮，提高神經(jīng)纖維再生速度，減輕肌肉萎縮對修復(fù)神經(jīng)功能至關(guān)重要。此外，隨著周圍神經(jīng)缺損長度的增加，神經(jīng)修復(fù)效果降低，如何增加移植神經(jīng)修復(fù)長度，已成為周圍神經(jīng)損傷研究重點(diǎn)之一。
　　 相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，CEAN中存在

3、有利于神經(jīng)生長的成分，也有不利于神經(jīng)再生的成分，將這些抑制神經(jīng)再生的物質(zhì)去除，并保留促神經(jīng)再生的物質(zhì)，將進(jìn)一步提高CEAN修復(fù)周圍神經(jīng)缺損效果。
　　 研究目的：
　　 1、對大鼠CEAN蛋白成分進(jìn)行電泳分析，了解CEAN中免疫原性蛋白殘存情況；在CEAN切片上，接種背根神經(jīng)節(jié)，觀察CEAN結(jié)構(gòu)對神經(jīng)再生的影響。
　　 2、為CEAN修復(fù)周圍神經(jīng)缺損補(bǔ)充緩釋的外源性神經(jīng)生長因子，觀察該方法對神經(jīng)再生生長速度、肌肉

4、萎縮、神經(jīng)組織再生情況的影響。
　　 3、應(yīng)用軟骨素酶ABC去除CEAN中不利于神經(jīng)再生的物質(zhì)-硫酸軟骨素蛋白多糖(Chondroitin Sulfate Proteoglycan，CSPG)，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)長距離缺損，評價去除CSPG對修復(fù)缺損距離的影響。
　　 研究方法：
　　 第一部分 CEAN蛋白成分及結(jié)構(gòu)特性
　　 按Sondell法制備大鼠的CEAN，將制備好的CEAN進(jìn)行電泳分析，觀察28

5、-30 kDa區(qū)域的髓鞘蛋白的殘留情況；將CEAN進(jìn)行冰凍切片，接種雞胚背根神經(jīng)節(jié)，進(jìn)行神經(jīng)纖維熒光染色，觀察神經(jīng)纖維在CEAN切片上的生長方向。
　　 第二部分神經(jīng)生長因子(NGF)復(fù)合緩釋制劑對提高CEAN修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的實驗研究
　　 采用復(fù)乳溶媒蒸發(fā)—萃取法，以聚乳酸羥基/乙酸共聚物為材料制備NGF微球，與纖維蛋白膠混合制備成補(bǔ)充外源性NGF復(fù)合緩釋制劑。體外進(jìn)行NGF復(fù)合緩劑藥物釋放曲線，與雞胚背根神經(jīng)節(jié)共培

6、養(yǎng)鑒定釋放NGF的活性。體內(nèi)實驗，以橋接大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損為模型，分為自體神經(jīng)移植組(A組)，CEAN+NGF復(fù)合緩釋制劑組(B組)；CEAN移植組(C組)：CEAN移植+纖維蛋白膠組(D組)，術(shù)后兩周測量神經(jīng)再生生長距離，術(shù)后4個月進(jìn)行神經(jīng)電生理、腓腸肌濕重、計算機(jī)圖像分析等方面評價神經(jīng)移植后的再生效果。
　　 第三部分去除CEAN中的CSPG對修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的實驗研究
　　 CEAN經(jīng)軟骨素酶ABC降解CSP

7、G后，進(jìn)行免疫組化染色，觀察CSPG去除效果和對去細(xì)胞異體神經(jīng)其它成分的影響。經(jīng)軟骨素酶ABC處理后的CSPG修復(fù)周圍神經(jīng)缺損為實驗組(A組)，橋接大鼠20mm周圍神經(jīng)缺損，對照組不作處理(B組)，術(shù)后3個月，評價其修復(fù)周圍神經(jīng)效果。
　　 研究結(jié)果：
　　 第一部分：CEAN電泳結(jié)果顯示：28-30kDa區(qū)域髓鞘蛋白完全消失，化學(xué)萃取的去細(xì)胞神經(jīng)可以完全去除髓鞘蛋白；背根神經(jīng)節(jié)發(fā)出大量的神經(jīng)纖維沿著CEAN基底膜管方向

8、生長；而CEAN切片外側(cè)僅有少量神經(jīng)纖維生長。
　　 第二部分：體外實驗證明，NGF復(fù)合緩釋制劑可持續(xù)釋放NGF達(dá)60天以上，釋出的NGF可促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維突起生長，具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性。術(shù)后2周A組神經(jīng)再生距離比其他組長(P<0.05)，B組優(yōu)于C和D組(P<0.05)；C、D組間無差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后16周，A、B、C及D組小腿三頭肌收縮力恢復(fù)率分別為85.33％±5.59％、69.79％±5.3

9、1％、64.46％±8.49％、63.35％±6.40％；A組優(yōu)于其他3組(P<0.05)，B、C、D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A、B、C及D組肌肉濕重恢復(fù)率分別為62.54％±8.25％、53.73％±4.56％、46.37％±5.68％、45.78％±7.14％； A組三頭肌濕重恢復(fù)率好于其他3組(P<0.05)，B組好于C和D組(P<0.05)；C、D組間無差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組織學(xué)圖像分析結(jié)果為B組在有

10、髓神經(jīng)纖維數(shù)量，軸突直徑，髓鞘厚度，均優(yōu)于C、D組(P<0.05)，軸突直徑小于與A組(P<0.05)。
　　 第三部分：CSPG免疫組化染色結(jié)果顯示，軟骨素酶ABC可以明顯去除CSPG，并保留促神經(jīng)生長的Laminin有效成分。動物實驗結(jié)果顯示，術(shù)后2個月，兩組都出現(xiàn)殘足情況，A組僅一只大鼠出現(xiàn)殘足，而B組6只大鼠出現(xiàn)殘足。據(jù)Wall自殘標(biāo)準(zhǔn)評分，兩組進(jìn)行等級資料秩和檢驗，P<0.05，兩者之間具有統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后3個月，A組

11、6只大鼠5只出現(xiàn)鉗夾痛覺試驗陽性，而B組僅1只大鼠出現(xiàn)陽性反應(yīng)。進(jìn)行四格表卡方檢驗，x2=4.42，P<0.05。兩組之間具有顯著性差異。在小腿三頭肌肌張力恢復(fù)率和小腿三頭肌肌濕重方面，兩組比較，A組均優(yōu)于B組。進(jìn)行近端與遠(yuǎn)端吻合口HE染色A組神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)優(yōu)于B組。
　　 結(jié)論：
　　 1、CEAN中無殘留引起免疫反應(yīng)的髓鞘蛋白，保留的基底膜管結(jié)構(gòu)對促神經(jīng)纖維再生具有引導(dǎo)性作用。
　　 2、NGF復(fù)合緩釋制劑可以