鹽酸多奈哌齊對血管性癡呆小鼠海馬神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5-p25和活性氧通路的影響.pdf

1、目的：血管性癡呆（VD）是由各種腦血管疾病導(dǎo)致的獲得性、持續(xù)性智能障礙綜合征，以學(xué)習(xí)、記憶功能損害為主要癥狀，可伴有語言、運(yùn)動、視空間及人格障礙。隨著社會人口日益老齡化和腦血管病后生存率的提高，由腦血管病造成的精神及智能損害曰益突出，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此探討其可能的發(fā)病機(jī)制，制定合理的治療方案已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的緊迫任務(wù)之一。
　　 近年研究顯示：谷氨酸的興奮毒性參與了血管性癡呆的病理機(jī)制。因此，減輕興奮性氨基酸（EAA

2、）的毒性作用，對于減輕缺血性腦損傷及其繼發(fā)的學(xué)習(xí)與記憶障礙，具有極為重要的意義。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（EAATS）作為清除興奮性氨基酸的主要物質(zhì)，在全腦缺血的發(fā)生機(jī)制和治療中發(fā)揮了重要作用。腦缺血時，細(xì)胞外液谷氨酸濃度持續(xù)大量升高，過度激活谷氨酸受體，導(dǎo)致Ca2+大量內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載可激活中性蛋白酶Calpain，使其對細(xì)胞酶產(chǎn)生過度降解，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能異常及細(xì)胞死亡。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5（Cdk5）參與突觸小泡循環(huán)、離子通道和

3、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，在突觸可塑性、學(xué)習(xí)與記憶過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Cdk5的激動亞基p35也是Calpain的作用底物之一，病理條件下，Calpain可使p35蛋白降解成p25蛋白，后者使Cdk5激酶活性失調(diào)，導(dǎo)致包括凋亡、興奮毒性等多種形式的細(xì)胞死亡。由活性氧（ROS）引起的氧化損傷是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要原因。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）是評價氧化和抗氧化程度的重要指標(biāo)。神經(jīng)元內(nèi)的氧化損傷和其他危害可引起Calpa

4、in介導(dǎo)的p35向p25的裂解。另外，Cdk5對自由基的產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)作用。已有證據(jù)表明，在缺血、缺氧等條件下，自由基引起的氧化損傷參與了線粒體破壞、細(xì)胞壞死和凋亡等過程。目前有關(guān)EAATs、Calpain-Cdk5和活性氧通路在VD發(fā)生中的作用尚鮮有報道。
　　 鹽酸多奈哌齊是膽堿酯酶抑制劑，可選擇性抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿（Ach）的降解，增加神經(jīng)細(xì)胞突觸間隙Ach的濃度，提高記憶腦區(qū)的神經(jīng)傳導(dǎo)功能，從而改善大腦學(xué)習(xí)和記憶能

5、力。有資料表明，多奈哌齊可增加VD患者受損腦區(qū)局部腦血流量，激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）的表達(dá)，降低海馬神經(jīng)元N-甲基.D.天門冬氨酸(NMDA）受體亞單位R1（NR1）的表達(dá)，通過影響p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的mRNA表達(dá)而改善學(xué)習(xí)和記憶功能，提示該藥除發(fā)揮膽堿酯酶抑制劑的作用外，還通過多通道、多靶點(diǎn)參與學(xué)習(xí)和記憶功能的調(diào)節(jié)。但該藥對EAATs和Calpain-Cdk5/p25通路以及ROS在VD中的作用尚未見報道?；?/p>

6、于此，本文通過探討EAATs和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，觀察該藥治療VD的效果并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.采用雙側(cè)頸總動脈反復(fù)三次缺血-再灌注方法，制備小鼠VD模型，并設(shè)立假手術(shù)組和藥物組（鹽酸多奈哌齊）；通過跳臺試驗和水迷宮試驗進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績測試，HE染色觀察海馬組織病理變化。
　　 2.采用免疫組化方法測定海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞膜上EAAT1和EAAT2的表達(dá)。
　　 3.免疫組化方法測定海馬

7、CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)Calpain I的表達(dá)。
　　 4.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和 Western-blot方法測定小鼠海馬組織Cdk5的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，Western-blot方法測定各組小鼠海馬組織p25表達(dá)。
　　 5.紫外分光光度法測定海馬神經(jīng)元SOD活性和MDA含量。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實驗成功建立了小鼠VD模型，經(jīng)HE染色顯示海馬神經(jīng)元受損嚴(yán)重，以缺血再灌注后6周時最

8、明顯，持續(xù)至術(shù)后8周仍未恢復(fù)正常。提示本模型能夠基本模擬臨床上VD的智能障礙，是比較理想的VD動物模型；鹽酸多奈哌齊通過減輕小鼠海馬病理損害而改善其學(xué)習(xí)和記憶能力，取得了相應(yīng)的治療效果。
　　 2.EAAT1和EAAT2作為對谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)起決定作用的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，在腦缺血-再灌注后8周內(nèi)小鼠海馬出現(xiàn)持續(xù)性高表達(dá)，與神經(jīng)元損傷和認(rèn)知能力下降相一致，提示EAATS異常繼而導(dǎo)致谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)，及其后的Ca2+信號系統(tǒng)功能障礙可能是

9、VD發(fā)生的重要因素。
　　 3.CalDainⅠ是Ca2+信號通路的重要組成部分，在腦缺血-再灌注后8周內(nèi)呈持續(xù)高表達(dá)，伴海馬神經(jīng)元受損，RT-PCR和Western-blot技術(shù)進(jìn)一步證實海馬組織Cdk5表達(dá)增加，其病理性激活因子p25的生成也相應(yīng)增高，提示CalpainⅠ-Cdk5/p25通路的表達(dá)增加參與了VD的發(fā)生。
　　 4.ROS的代表性物質(zhì)SOD和MDA參與了VD的發(fā)生，提示氧化應(yīng)激在腦缺血-再灌注后癡呆的