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文檔簡介
1、目的:整合素(integrins)是一類普遍存在于細胞表面的跨膜糖蛋白。支氣管上皮細胞構成氣道的上皮屏障,其結構穩(wěn)定性的維持,依賴于細胞表達的整合素分子與細胞外基質(zhì)蛋白形成異源粘附,將細胞“錨定”于基膜上。同時,在氣道高反應或氣道炎癥發(fā)生過程中,部分整合素亞單位及其配體還參與了炎癥細胞的移行和活化,使氣道結構和完整性遭到破壞,氣道上皮剝脫。本室的前期研究已證實哮喘患者多個粘附分子表達異常,其中integrinβ4在所有哮喘病人檢測樣本中
2、均表達下調(diào)。那么,integrinβ4的表達失平衡在哮喘易感人群中是否具有普遍性;它的異常表達機制是什么;integrinβ4的表達失平衡與哮喘的發(fā)生發(fā)展過程是否具有密切關系。本課題將圍繞這一研究目的,通過哮喘實驗動物模型和臨床診斷哮喘患者這兩方面設計實驗來開展研究。 方法:一、建立哮喘動物模型,檢測integrinβ4表達與哮喘的相關性。 1.SPF級SD大鼠12只,按隨機數(shù)字表法分為哮喘組(n=6),對照組(n=6)
3、。其中哮喘組分別于第1天、第13天經(jīng)腹腔注射10%OVA和10%氫氧化鋁混合液1ml,14 d后用1% OVA溶液霧化吸入誘喘,每天1次,每次30min,連續(xù)7d。對照組用等量生理鹽水代替。 2.利用小動物呼吸機和Buxco小動物呼吸功能分析系統(tǒng),測定氣道阻力和動態(tài)肺順應性; 3.收集肺泡灌洗液中細胞,涂片吉姆薩染色后進行細胞計數(shù)及分類。 4.無菌條件下取肺組織,進行肺組織切片檢查。 5.肺組織切片免疫組
4、化觀察Integrinβ4在對照組和正常組支氣管上皮細胞、基底細胞、肺泡上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞表達變化。 6.Trizol提取肺組織中RNA,Real-time PCR反應觀察Integrinβ4在對照組和正常組表達變化。 二、臨床哮喘患者integrinβ4表達與哮喘的相關性及機制探討 1.Trizol抽提哮喘患者外周血白細胞RNA,隨機引物將RNA反轉錄成cDNA,然后設計特異性的引物和熒光探針(TaqMan
5、探針),進行熒光定量PCR檢測integrinβ4表達。 2.提取哮喘患者外周血白細胞DNA,應用PCR法擴增哮喘患者外周血白細胞integrinβ4基因5’調(diào)控區(qū),進行正反雙向測序及序列變異分析。 結果:一、Integrinβ4在哮喘動物模型中的表達與哮喘的相關性 1、哮喘模型組激發(fā)前后氣道阻力RL增加的百分比和動態(tài)肺順應性Cdyn降低的百分比均為對照組的2倍左右。 2、哮喘模型組細胞總數(shù)及嗜酸性細胞、
6、中性粒細胞比例均高于正常對照組。 3、哮喘模型組大鼠存在明顯支氣管收縮征象及周圍炎癥細胞浸潤,小血管周圍、肺泡腔、肺間質(zhì)大量炎細胞浸潤,并可見支氣管上皮細胞脫落,肺動靜脈周圍水腫及呼吸性細支氣管阻塞。正常對照組無此變化。以上結果證實哮喘動物模型的成功建立。 4、免疫組化顯示Integrinβ4在支氣管上皮細胞、基底細胞、肺泡上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞均有較高表達,在哮喘模型大鼠中表達下降。 5、Real-time P
7、CR反應測定哮喘模型大鼠Integrinβ4表達下調(diào)。 二、臨床哮喘患者integrinβ4表達與哮喘的相關性及機制探討 1、Real-time PCR檢測顯示Integrinβ4 mRNA在哮喘患者外周血白細胞中表達下調(diào)。 2、哮喘患者外周血白細胞Integrinβ45’調(diào)控區(qū)基因序列存在變異。哮喘患者的-nt1029、-nt1051由G突變?yōu)锳,-nt1151由T突變?yōu)镚,-nt1164由G突變?yōu)镃,提示哮喘
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