IL-24對上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞株生物學(xué)的影響研究（臨床前研究）.pdf

1、目前，以手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療為主的綜合治療模式提高了癌癥患者的生存率，但卵巢癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍較高。生物治療應(yīng)用于卵巢癌的臨床前實(shí)驗(yàn)研究取得了較大進(jìn)展，給卵巢癌特別是晚期患者的治療帶來了新的希望。 IL-24基因是一重要的抑癌基因，其過量表達(dá)能選擇性地抑制黑色素瘤細(xì)胞分化并誘導(dǎo)其凋亡，如功能喪失將導(dǎo)致黑色素瘤生長加快并具侵襲性。國外學(xué)者利用IL-24基因的重組腺病毒制劑用于20株癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有19株癌細(xì)胞發(fā)生了凋

2、亡。 IL-24基因表達(dá)產(chǎn)物能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，但不影響正常細(xì)胞，且具有通過刺激免疫應(yīng)答來發(fā)揮抗腫瘤的活性。所以IL-24被認(rèn)為具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，對其功能的研究極具理論和臨床意義。 為探索IL-24對上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞株生物學(xué)的影響，本實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)部分：第一部分 IL-24真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-his(-)B-IL-24的構(gòu)建及鑒定；第二部分穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc-his(-)

3、B-IL-24的上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞株增殖、細(xì)胞周期、凋亡率及相關(guān)凋亡蛋白的變化；第三部分IL-24對上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞株放療敏感性的改變觀察；第四部分穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc-his(-)B-IL-24的上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞株裸鼠成瘤試驗(yàn)，IL-24對上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞株裸鼠移植瘤模型治療試驗(yàn)研究。 目的：IL-24真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-his(-)B-IL-24的構(gòu)建及鑒定

4、。 方法：分離人外周血淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，自行設(shè)計(jì)特異性引物，對IL-24編碼序列進(jìn)行克隆，通過基因重組，連接到pcDNA3.1-myc-his(-)B載體上，構(gòu)建IL-24真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-his(-)B-IL-24，用PCR、酶切鑒定和序列測定證實(shí)序列無誤后，大量擴(kuò)增。 結(jié)果： 1、正常人外周血淋巴細(xì)胞中提取的總RNA質(zhì)量檢測：從正常人外周血淋巴細(xì)胞中提取的總RNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝

5、膠電泳，可見28s、18s、5s三條帶，且28s的光密度值是18s的兩倍，表示該RNA樣品完整性好，降解少。 2、總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增IL-24基因：以總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增IL-24 cDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出約為600+bp大小的特異性條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)的IL-24 cDNA大小相符。 3、PCR鑒定：以構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-his(-)B-IL-24為模板，PCR擴(kuò)增IL-

6、24 DNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出約為600+bp大小的特異性條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)的IL-24 DNA大小相符。 4、酶切鑒定：經(jīng)藍(lán)白篩選后，挑取數(shù)個(gè)單菌落擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，用BamHI和Hind Ⅲ雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，可見被酶切的質(zhì)粒出現(xiàn)兩條帶，約5.4Kb、600+bp大小，分別與pcDNA3.1-myc-his(-)B和IL-24基因片段大小一致。pcDNA3.1-myc-his(-)B上有兩個(gè)Xba I酶切位點(diǎn)

7、，用Xba I單酶切后，1％瓊脂糖凝膠電泳，可見被酶切的質(zhì)粒出現(xiàn)兩條帶，約5.4Kb、600+bp大小，分別與pcDNA3.1-myc-his(-)B和IL-24基因片段大小一致。 5、質(zhì)粒的測序結(jié)果：對經(jīng)上述鑒定后符合要求的質(zhì)粒交invitrogen公司進(jìn)行序列測定，經(jīng)NCBI提供的BLAST程序分析對比，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)獲得的IL-24序列與genebank公布的IL-24基因序列完全一致，符合預(yù)期結(jié)果。 結(jié)論：