PEA3和GDNF在小鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的表達及意義的研究.pdf

1、腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)是由位于胃腸道壁(包括胰和膽囊)內(nèi)的神經(jīng)元、神經(jīng)遞質(zhì)和蛋白質(zhì)及其支持細(xì)胞所組成的系統(tǒng)，這些神經(jīng)元起源于神經(jīng)嵴組織。位于消化道壁內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)主要由2組神經(jīng)元及其纖維網(wǎng)交織而成，分別是位于縱行肌與環(huán)行肌之間的肌間神經(jīng)叢(auerbach plexus)和位于粘膜層與環(huán)行肌之間的粘膜下神經(jīng)叢(meissner plexus)。前者主要與腸道的運動有關(guān),后者主要與腸道的分泌、吸收

2、功能有關(guān)。當(dāng)肌間神經(jīng)叢發(fā)育障礙時，腸道運動功能不良，可導(dǎo)致便秘等多種臨床癥狀和疾病，如先天性巨結(jié)腸(Hirchsprung’s disease，HD) 。 多瘤促活化因子(Polymoma virus enhancer-3，PEA3)基因?qū)儆贓TS轉(zhuǎn)錄因子基因家族，其編碼生成的蛋白在神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移與分化過程中發(fā)揮功能，尤其在運動神經(jīng)元的遷移、分化和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，PEA3是膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子（glia

3、l cell line-derived neurotrophic factor GDNF）的下游作用靶，在GDNF發(fā)揮作用中是一個重要因素，在PEA3和GDNF突變型中均觀察到相似的神經(jīng)細(xì)胞遷移障礙。同時，以往的研究發(fā)現(xiàn)，GDNF表達缺陷使神經(jīng)前體細(xì)胞過早調(diào)亡引起腸神經(jīng)系統(tǒng)的異常，是HD發(fā)病的一個重要因素。SOX-10基因是HD發(fā)病的敏感基因之一，基因敲除的小鼠表現(xiàn)出HD的多種臨床癥狀。但PEA3蛋白在HD和HAD(先天性巨結(jié)腸同源病)

4、的發(fā)病過程中是否發(fā)揮作用，目前還沒有相關(guān)報道。用免疫組織化學(xué)的方法系統(tǒng)探討PEA3、GDNF蛋白在小鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢發(fā)育過程中的表達及相關(guān)性；探討PEA3蛋白在SOX-10基因敲除小鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的表達變化；為進一步探討HD和HAD的病因提供實驗依據(jù)。 本實驗分兩個部分對HD和HAD的發(fā)病機制進行研究： 第一部分采取成年健康雌性昆明小鼠13只，體重50～60g，與體重80g證實有生育能力的雄性昆明小鼠按一雄一雌于下午四

5、時合籠進行交配，于每天清晨檢查發(fā)現(xiàn)雌鼠陰道有陰栓者或鏡檢有大量精子者為交配成功，定為孕1天。分別在孕10、14、19天小鼠各1例取其胚胎結(jié)腸組織，石蠟包埋，每一例蠟塊每連續(xù)切片5張留1張，片厚6微米。免疫組織化學(xué)方法：分別以兔抗鼠PEA3單克隆抗體（由SANTA CRUZ公司提供，稀釋度1:400）、兔抗鼠GDNF單克隆抗體（由博士德公司提供，稀釋度1:100）為一抗，運用免疫組織化學(xué)SABC方法，DAB染色。以PBS代替第一抗血清作對

6、照，結(jié)果染色陰性。觀察PEA3和GDNF蛋白在小鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢發(fā)育過程中的分布，探討其與HD腸動力障礙發(fā)生的關(guān)系。 第二部分取SOX-10基因敲除小鼠5只分別取其升結(jié)腸、乙狀結(jié)腸，石蠟包埋，取正常小鼠1只作為對照。每一例蠟塊做連續(xù)切片3張，片厚6微米，依次編號為1、2、3。第一張切片行HE染色，第二張切片行免疫組化染色，第三張切片作甲苯胺藍(lán)特染。免疫組織化學(xué)方法同第一部分。觀察PEA3蛋白在正常小鼠與SOX-10基因敲除小鼠結(jié)

7、腸肌間神經(jīng)叢分布的差異，以進一步闡述HD腸動力障礙的發(fā)病機制。 實驗結(jié)果： 第一部分實驗中，觀察到PEA3、GDNF蛋白表達光密度平均值在結(jié)腸發(fā)育早期較低，GDNF蛋白表達在胚胎發(fā)育中期達到峰值，在結(jié)腸發(fā)育后期下降。PEA3蛋白的表達則隨胎齡的增加而增加，且二者在早期和中期不同胚齡小鼠結(jié)腸中的表達變化具有一致性。 第二部分的實驗中，觀察到在基因敲除小鼠升結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中，PEA3陽性細(xì)胞數(shù)量較正常組變化不明顯，細(xì)

8、胞中PEA3陽性顆粒的含量減少；在乙狀結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中觀察到PEA3陽性細(xì)胞數(shù)量較正常組略有下降（P〈0.05），細(xì)胞中PEA3陽性顆粒的含量減少。光密度分析結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析得出PEA3在基因敲除組與正常組中的表達差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.01）。 結(jié)果提示：在結(jié)腸肌間神經(jīng)叢發(fā)育的早期及中期PEA3和GDNF蛋白的表達變化具有一致性，并且GDNF可能作為PEA3的上游基因表達產(chǎn)物影響其在小鼠結(jié)腸發(fā)育過程中的表達，PEA3表