日本沼蝦亞硝酸鹽抗性相關基因的篩選與鑒定.pdf

1、日本沼蝦(Macrobrachium nipponinse)，俗名青蝦，自然分布于中國、日本、越南以及緬甸等地區(qū)，廣泛分布于我國各地淡水水域。是我國最重要的淡水經濟蝦類之一。在養(yǎng)殖水體中，亞硝酸鹽含量是影響日本沼蝦生長發(fā)育的最重要的水質指標之一，研究和揭示日本沼蝦抵抗亞硝酸鹽脅迫的分子機制，可以為培育抗逆性強的個體奠定基礎；為日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，尤其是提高養(yǎng)殖成活率提供重要依據。
　　近幾年，Illumina高通量測序技術成為各

2、物種轉錄組分析鑒定的有力工具，在蝦類研究中，與低氧脅迫相關的高通量測序已有報道，但與亞硝酸鹽相關的基于Illunina平臺測序方面的研究尚未見報道。本研究將日本沼蝦飼養(yǎng)于亞硝酸鹽濃度為10mg/L(96 LC-50)的環(huán)境下，48h時提取其肝胰腺，并與正常飼養(yǎng)條件下蝦的肝胰腺為對照，進行高通量測序和比對檢測。主要研究結果如下：
　?。?）10mg/L濃度的亞硝酸鹽脅迫48h后，日本沼蝦肝胰腺與對照組沼蝦的肝胰腺高通量測序結果顯示，

3、經過測序質量控制，共得到34.68Gb Clean Data，各樣品Q30堿基百分比均不小于86.33％，各樣品Clean Data均達到5.37Gb，De novo組裝后共獲得56，054條Unigene。其中長度在1kb以上的Unigene有14，373條。對Unigene進行功能注釋，包括與 NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數據庫的比對，共獲得19，022條Unigene的注釋結果。進行基因在各

4、樣品中的表達量分析?；诨蛟诓煌瑯悠分械谋磉_量，識別差異表達基因。對差異表達基因進行模式聚類、功能注釋以及富集性分析。
　?。?）選擇15個差異表達的unigenes，用qRT-PCR驗證了在脅迫組和正常組中的表達差異，結果顯示，熒光定量檢測結果與測序結果的表達趨勢相一致。進一步對差異表達基因進行生物信息學分析，選取與免疫相關的影響細胞信號轉導通路的關鍵基因進行功能研究。
　?。?）選取Guaninenucleotide-

5、binding protein和Lysosome兩種關鍵基因，分別檢測了其肝胰腺在亞硝酸鹽脅迫下不同時間段(4h，10h，24h，48h，72h，96h)的mRNA表達量，結果顯示 Lysosome基因在4h時出現(xiàn)表達，10h時表達量最高。Guaninenucleotide-binding protein基因在10h和48h時表達量均達到峰值。這兩種基因在48h時的肝胰腺、鰓和肌肉三種組織中有不同的表達量，其都在肌肉中的表達量最高，兩種

6、基因在對抗亞硝酸鹽脅迫時在肌肉組織中的表達最為活躍。
　　（4）對正常飼養(yǎng)條件下的日本沼蝦和亞硝酸鹽脅迫下的肝胰腺進行組織學比較，電鏡觀察結果顯示，隨著亞硝酸鹽脅迫時間的增加，肝胰腺細胞逐漸出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，管壁細胞與基膜分離，嚴重時管壁破裂，這說明亞硝酸鹽脅迫會損傷或破壞肝胰腺的組織結構，進而會影響肝胰腺的生理功能，影響動物體內酶的催化作用和細胞膜的穩(wěn)定性，進而破壞滲透壓的平衡。脅迫48h時，粗面內質網上的核糖體顆粒開始大量脫落，內

7、質網嚴重水腫，線粒體內部局部瓦解，線粒體雙層膜溶解，出現(xiàn)電子透明區(qū)，部分趨于解體；微絨毛變形和少數破損，表明久效亞硝酸鹽對肝胰臟已構成了較大的損傷和破壞，隨著處理時間的延長，對細胞器的損傷越來越嚴重。
　　綜上所述，本研究對日本沼蝦轉錄組進行測序，獲得了大量的轉錄組信息，為日本沼蝦的轉錄組研究提供了基礎數據。選擇一些關鍵基因，得到了其在各組織中的差異表達情況，進一步對差異表達基因進行了研究，推測出在抗亞硝酸鹽脅迫中的關鍵基因，研究