攻擊PLK1 mRNA的小干擾RNA抑制肺癌A549細(xì)胞PLK1基因表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景和目的: 肺癌是目前世界上最常見的男性惡性腫瘤,占全部惡性腫瘤的16﹪,惡性腫瘤死亡的28﹪,在大多數(shù)國家已經(jīng)成為癌癥死因的首位. 近三年來,肺癌的分子靶向治療發(fā)展迅速,為肺癌的治療帶來了新的曙光.如最近獲準(zhǔn)美國FDA認(rèn)證并上市的EGFR(表皮生長因子受體)酪氨酸激酶抑制劑工RESSA和TARCEVA,通過高選擇性地與EGFR結(jié)合,抑制酪氨酸激酶活性,影響腫瘤細(xì)胞生長、增殖和分化.這種針對(duì)異常的信號(hào)傳導(dǎo)通路的藥物

2、比傳統(tǒng)藥物具有更好的療效和更低的毒性,使之成為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)藥物.但是Ⅱ期臨床試驗(yàn)的有效率分別僅為11.8﹪-18.4﹪和12.5﹪.所以,仍然需要尋找更為有效和特異的治療方法. PLKl(polo-like kinase 1)是人體內(nèi)類似于黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)體內(nèi)的polo、啤酒酵母體內(nèi)的CDC5的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,目前研究表明,它與有絲分裂過程中的紡錘體形成及染色體的分離有密切的關(guān)

3、系,已經(jīng)成為細(xì)胞周期檢控點(diǎn)(cell cycle checkpoint)的主要調(diào)節(jié)者,許多細(xì)胞周期關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子,如Cdc25C、 cyclinB、APC、p53、有絲分裂動(dòng)力蛋白,都是PLKl的直接作用對(duì)象,PLKl的高表達(dá)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性.許多研究表明,抑制PLKl的表達(dá)可以顯著的抑制腫瘤的生長,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,而對(duì)正常細(xì)胞的增殖影響極少.因此,抑制PLK1的功能將成為腫瘤治療的一項(xiàng)重要手段. 短(

4、小)干擾RNA(short or small interfering RNA,siRNA)技術(shù)已被認(rèn)為是近年來生物技術(shù)中最重大的發(fā)現(xiàn),成為一種抑制哺乳動(dòng)物特定的基因表達(dá)研究的重要方法.其最令人振奮和感興趣的是它在抑制腫瘤"關(guān)鍵基因"顯示的治療前景.阻止癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡是腫瘤基因治療的最基本規(guī)則,目前研究表明將siRNA轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi),通過使靶基因mRNA沉默,從而達(dá)到定向"敲除"與腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因,在實(shí)踐中是可行的.本研究

5、的目的就是探索靶向性的siRNA對(duì)肺癌A549細(xì)胞有絲分裂調(diào)控基因PLK1基因表達(dá)的沉默效果. 本實(shí)驗(yàn)采用siRNA干預(yù)肺癌A549細(xì)胞PLK1基因的表達(dá),觀察其抑制效果,從而探尋具高度活性的針對(duì)A549細(xì)胞PLK1的siRNA及其最佳轉(zhuǎn)染途徑,為下一步siRNA用于體內(nèi)抑制肺癌生長研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ). 研究方法: 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)并人工化學(xué)合成針對(duì)肺癌A549細(xì)胞PLK1 mRNA的高純度siRNA,

6、用陽離子脂質(zhì)體(lipofectamirre2000)包裹,以不同濃度轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞.轉(zhuǎn)染后24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)分別采用實(shí)時(shí)定量PCR同時(shí)檢測(cè)PLK1 mRNA和GAPDH mRNA,并以內(nèi)參照GAPDH的mRNA相對(duì)定量PLK1 mRNA表達(dá)水平;Western-blot同時(shí)觀察PLK1和GAPDH蛋白表達(dá)的變化. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法兩組間的比較采用two-way ANOVA檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)在stata 8.0 for w

7、indows軟件上完成. 結(jié)果: siRNA可不同程度的抑制PLK1基因的表達(dá),在分別以25nmol/L和50nmol/L濃度轉(zhuǎn)染后24小時(shí)即可檢測(cè)到mRNA的豐度明顯下降到25﹪和23.1﹪,48和72小時(shí)繼續(xù)下降到17.5﹪和19.5﹪,13.4﹪和8.4﹪;轉(zhuǎn)染后48小時(shí)開始可檢測(cè)到PLK1蛋白表達(dá)明顯降低,轉(zhuǎn)染后72小時(shí)仍有持續(xù)的抑制效果,其表達(dá)水平低于檢測(cè)低限,而GAPDH蛋白表達(dá)水平不受影響.采用nonsen

8、se siRNA的對(duì)照組PLK1基因表達(dá)亦不受抑制. 結(jié)論： 1) siRNA干預(yù)PLK1基因表達(dá)后,PLK1 mRNA水平明顯下降,而GAPDHmRNA無明顯變化,提示siRNA具有靶向性; 2) siRNA在25nmol濃度即可顯著抑制PLK1 mRNA達(dá)91.6﹪(72小時(shí)),提示siRNA的作用具有高效性和一定的持久性;脂質(zhì)體(lipofectamine2000)作為一種siRNA轉(zhuǎn)染載體,轉(zhuǎn)染肺癌A54

9、9細(xì)胞效率高; 3)本研究的siRNA對(duì)肺癌A549細(xì)胞沉默效果優(yōu)于其他RNAi(RNAinterference)文獻(xiàn)的研究結(jié)果(最高抑制83﹪),可能與靶位點(diǎn)的選擇和轉(zhuǎn)染載體的差異有關(guān); 4)25nmol和50nmol兩組抑制效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示可進(jìn)一步降低濃度觀察觀察和比較干預(yù)效果; 5)干預(yù)后PLK1 mRNA僅表現(xiàn)為表達(dá)水平的下調(diào),但蛋白水平已低于檢測(cè)低限,可能與siRNA的存在翻譯水平的抑制機(jī)制(tr