肺癌PLK1基因多態(tài)性及siRNA干預(yù)的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 肺癌是目前全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,其死亡率在我國惡性腫瘤死亡率中占第一位,嚴(yán)重威脅人們的生命健康。除了手術(shù)、放療及傳統(tǒng)化療藥物之外,更多研究開始關(guān)注于分子靶向藥物的開發(fā),但由于這些藥物療效的不穩(wěn)定性,一般僅作為肺癌治療的二線藥物。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展,siRNA干擾技術(shù)等基因治療技術(shù)越來越成為研究的熱點。
　　 PLK1是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族中的一員,與有絲分裂過程中紡錘體的形成及染色

2、體的分離等有密切的關(guān)系,大量研究發(fā)現(xiàn)它的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等有顯著的相關(guān)性。因此利用siRNA技術(shù)調(diào)節(jié)PLK1基因在肺癌組織內(nèi)的表達(dá)量,會對非小細(xì)胞肺癌有一定的治療價值。研究已證明,利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染靶向PLK1基因的特異性siRNA,可降低PLK1基因的表達(dá),從而抑制多種人類腫瘤細(xì)胞株的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提示同樣方法抑制人肺腺癌細(xì)胞株A549的可能性。
　　 另外,為了保證siRNA抑制效

3、果的特異性,靶向基因序列的選擇極為重要,單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)等基因突變的存在可能會影響到siRNA與靶向基因的特異性結(jié)合。而PLK家族的PLK3基因已被發(fā)現(xiàn)存在有SNP,因此推斷同樣是plk家族的PLK1基因存在有相似基因突變的可能性。所以,在設(shè)計PLK1特異性siRNA之前,我們先對PLK1基因開放閱讀框區(qū)域(Openreadingframe)的多態(tài)性進(jìn)行了研究。另外,由于

4、siRNA的轉(zhuǎn)染效率受到轉(zhuǎn)染時間及轉(zhuǎn)染濃度等的影響,因此在研究siRNA的干擾效果之前,我們先通過預(yù)實驗選擇了最佳siRNA轉(zhuǎn)染濃度及最佳轉(zhuǎn)染后檢測時間。
　　 本實驗研究小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(NCI-H446)、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549、SK-MES-1)、永生化人支氣管上皮細(xì)胞株(BEAS-2B)及肺癌手術(shù)標(biāo)本中PLK1基因ORF區(qū)域多態(tài)性。并優(yōu)化設(shè)計針對PLK1基因的siRNA,經(jīng)Lipofectamine2000包裝轉(zhuǎn)染

5、,探索最安全有效的siRNA作用時間和劑量,并觀察其對人肺腺癌A549細(xì)胞PLK1mRNA和蛋白表達(dá)的影響,及對細(xì)胞增殖及生存活力的影響,為PLK1特異性siRNA治療肺癌的可能性提供實驗依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容和方法第一部分:在小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、正常支氣管上皮細(xì)胞株及30例肺癌標(biāo)本中采用基因測序的方法篩查出可能存在的PLK1基因ORF區(qū)域的多態(tài)性。
　　 第二部分:避開突變片段,針對肺癌PLK1mRNA的保守序列

6、設(shè)計特異性siRNA,采用Lipofectamine2000包裝轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并優(yōu)化轉(zhuǎn)染濃度、時間等轉(zhuǎn)染條件;設(shè)計未處理的A549作為空白對照,單純PLK1siRNA、單純Lipofectamine2000、錯義序列組(陰性對照)、GAPDHsiRNA(陽性對照)為實驗對照組,與轉(zhuǎn)染PLK1特異性siRNA的A549細(xì)胞作比較,用Real-TimePCR及Westem-blot的方法分別觀察導(dǎo)入前后PLK1mRNA和蛋白表達(dá)的影響,MTT法

7、及流式細(xì)胞分析技術(shù)分別觀察細(xì)胞增殖和凋亡能力的改變。
　　 統(tǒng)計分析:實驗所得數(shù)據(jù)運用SPSS11.0軟件統(tǒng)計處理,均數(shù)間兩兩比較采用oneway-ANOVA檢驗,以p＜0.05為顯著性差異;單樣本與群體樣本之間的差異性用單樣本t檢驗,以雙尾檢測概率P值＜0.05為顯著性差異。
　　 研究結(jié)果：
　　 A549、NCI-H446、SK-MES-1及BEAS-2B細(xì)胞株P(guān)LK1基因的ORF區(qū)域無多態(tài)性,但前三者PL

8、K1基因的表達(dá)量明顯高于BEAS-2B,提示肺癌細(xì)胞株P(guān)LK1基因表達(dá)量的異常并非plk1自身基因突變所致,其表達(dá)水平在肺癌細(xì)胞株內(nèi)可能與轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后異常調(diào)節(jié)有關(guān)。30例肺癌患者組織標(biāo)本中檢測到一例患者PLK1基因的ORF區(qū)域有SNP(為1114位點鳥嘌呤向腺嘌呤的突變),該例突變屬于雜合SNP,目前尚無法確定其對plk1表達(dá)水平、基因功能及其對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響,有待進(jìn)一步的研究明確。
　　 選擇PLK1基因的606到627位

9、點作為靶向基因片段設(shè)計siRNA,MTT法比較轉(zhuǎn)染不同濃度及不同時間后A549細(xì)胞活力的改變,根據(jù)細(xì)胞活力受抑制率確定120nM及72h為最佳siRNA轉(zhuǎn)染濃度及轉(zhuǎn)染后最佳檢測時間。
　　 Real-TimePCR及Westem-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLK1siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后能明顯抑制PLK1基因的表達(dá)(p＜0.05),但其對蛋白表達(dá)的抑制率(62.0％)低于對mRNA表達(dá)的抑制率(95.93％)。
　　 MTT法

10、及流式細(xì)胞分析技術(shù)結(jié)果顯示PLK1siRNA能明顯抑制A549細(xì)胞增殖(抑制率達(dá)70.72％),促進(jìn)細(xì)胞死亡(死亡率14.94％);這一結(jié)果驗證了既往的研究結(jié)果,表明PLK1在A549細(xì)胞增殖和死亡過程中起了非常關(guān)鍵的作用,它的異常表達(dá)是A549細(xì)胞較正常支氣管上皮細(xì)胞增殖活躍的主要原因之一。
　　 結(jié)論：
　　 1、三種肺癌細(xì)胞株P(guān)LK1基因的表達(dá)明顯高于正常支氣管上皮細(xì)胞株,但這四種細(xì)胞株P(guān)LK1基因ORF區(qū)域均無基