塵螨變應(yīng)原特異的重組人單抗IgG Fab片段的制備及生物學(xué)活性研究.pdf

1、變態(tài)反應(yīng)性疾病特別是哮喘是危害嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題,在大多數(shù)國家,哮喘的發(fā)病率及死亡率呈持續(xù)上升趨勢。塵螨變應(yīng)原是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要病因之一,特別是引起兒童變應(yīng)性哮喘的重要危險因子。變應(yīng)性疾病的病因復(fù)雜,除了復(fù)合多基因式遺傳外,出生前后與環(huán)境變應(yīng)原的接觸也至關(guān)重要。鑒于此,WHO提出兒童變應(yīng)性疾病的三級預(yù)防理論并呼吁一級預(yù)防應(yīng)成為今后研究的重點。多項研究表明孕期母體高水平的變應(yīng)原特異IgG抗體對胎兒今后發(fā)生變應(yīng)性疾病具有抑制作

2、用。因此,本課題擬制備塵螨變應(yīng)原特異的人源抗體IgGFab片段用于螨性變應(yīng)性疾病的防治研究。
　　首先分離接受塵螨注射液脫敏治療并證實具有高水平抗塵螨IgG的變應(yīng)性哮喘患者的外周血淋巴細(xì)胞,提取總RNA,構(gòu)建非依賴性克隆滴度為8×108的抗塵螨變應(yīng)原的IgG抗體庫;同時分離近兩個月內(nèi)未曾患感冒等感染性疾病的300名健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞,同法構(gòu)建非依賴性克隆滴度為9×108的人IgG抗體庫。以實驗室培養(yǎng)的粉塵螨制備粉塵螨螨體浸

3、出液、代謝培養(yǎng)基浸出液并利用基因工程手段制備重組2類變應(yīng)原rDerf2。分別以上述天然粗抗原及重組變應(yīng)原作為抗原,采用克隆印跡法和ELISA法對抗體庫進(jìn)行多輪篩選,共篩選克隆數(shù)約為1.8×106個,經(jīng)反復(fù)驗證,最終獲得兩個可與塵螨變應(yīng)原特異性結(jié)合的陽性克隆,命名為AM1和AM2,序列比較的結(jié)果顯示兩個克隆的重鏈?zhǔn)峭耆吹?。陽性克隆AM1的輕鏈與抗塵螨變應(yīng)原的重鏈庫重組,構(gòu)成重鏈更替的抗體庫,以重組的Derf2作為抗原,經(jīng)克隆印跡法篩選

4、,獲得1個親和力提高的特異性陽性克隆AM1L-Hsh。AM1的輕鏈可變區(qū)近似系為K2-30,基因同源性為87％;重鏈可變區(qū)近似系為VH3-30,基因同源性為96％;AM2的輕鏈可變區(qū)近似系為K3-27,基因同源性為95％:AM1L-Hsh的重鏈可變區(qū)近似系為VH5-1。對上述3個Fab片段進(jìn)行大量表達(dá),并以金屬螯合親和層析法進(jìn)行純化,表面等離子共振BIAcore檢測顯示均有較高的親和力,解離常數(shù)在1.27×10-9～6.3×10-8之間