Bim蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其與PI3K-Akt通路的關(guān)系.pdf

1、目的： Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)是Bcl-2家族BH3-only亞家族的成員，是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白。Bim廣泛表達(dá)于正常細(xì)胞，其中包括造血細(xì)胞，上皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞以及生殖細(xì)胞。PI3K/Akt信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增生、分化和代謝等一系列生理活動，現(xiàn)有許多研究表明PI3K/Akt信號通路異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究證實，不同的生長因子刺激后，PKB

2、/Akt磷酸化forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子，改變其胞內(nèi)定位。在沒有PKB/Akt作用的情況下，forkhead家族主要定位于核內(nèi)，通過結(jié)合到特異順式作用元件促進(jìn)Fas-L、IGFBP1和Bim等凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。近有報道，在Ba/F3細(xì)胞，激活的Akt可以直接磷酸化BimEL的Ser87位點(diǎn)，促進(jìn)其的泛素化和降解。本科研組的前期工作發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt-Bad通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，Bim、Bad同屬于BH3-onl

3、y亞家族，那么在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，Bim是否扮演著同樣重要的角色，這對指導(dǎo)乳腺癌的臨床診斷和治療有重要意義。 材料和方法： 1、材料 (1)臨床資料：101例乳腺組織取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院，為2001-2005年手術(shù)切除標(biāo)本。依據(jù)WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)(2003)進(jìn)行組織學(xué)分級，其中乳腺正常組織15例，普通導(dǎo)管增生病變組織12例，乳腺導(dǎo)管輕中度不典型增生病變組織10例，重度不典型增生及導(dǎo)管原位癌

4、病變組織17例，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病變組織47例。 (2)細(xì)胞系：人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞系購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。細(xì)胞分別在37℃、5％CO<,2>、含10％胎牛血清的DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底時棄去培養(yǎng)液，0.25％胰蛋白酶消化傳代。 2、試劑 第一抗體分別為兔抗人Bim多克隆抗體(購買自Neomarkers公司)和兔抗人p-Akt1/2/3(Ser473)多

5、克隆抗體(購自Santa Cruz公司)。PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002購自Cell Signaling公司。免疫組化染色過程采用的即用型S-P試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。WesternBlotting用二抗及兔抗人多克隆anti-β-actin抗體(PR-0255)均購自中山生物技術(shù)有限公司。DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)基購白購自Gibco公司。 3、方法 (1)免疫

6、組化(S-P)法：①步驟：按鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)法試劑盒說明書步驟行免疫組織化學(xué)染色。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。②結(jié)果判定：以細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為Bim表達(dá)陽性細(xì)胞。鏡下選擇10個高倍視野的1000個腫瘤細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞的百分率分為四個等級：0分無陽性細(xì)胞；1分陽性細(xì)胞>30％；2分陽性細(xì)胞30％～70％；3分陽性細(xì)胞>70％。按染色強(qiáng)度將其也分為個等級：0分無陽性細(xì)胞；1分陽性細(xì)胞

7、染色呈淺黃色；2分陽性細(xì)胞染色呈黃色；3分陽性細(xì)胞染色呈棕黃色。陽性細(xì)胞數(shù)評分與染色強(qiáng)度評分相加后除以2得出綜合評分。綜合評分≥2分為陽性表達(dá)。 (2)Western印跡法：待細(xì)胞至90％融合狀態(tài)時，冰冷的PBS沖洗細(xì)胞兩次，加入0.25％胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。在收集的細(xì)胞內(nèi)加入裂解液反復(fù)吹打，4℃靜置30min，離心提取上清為總蛋白。不同終濃度的LY294002(0、10、25、50μmol/L)處理MCF～7細(xì)胞24h后，

8、按上述方法提蛋白，用Bradford法測蛋白濃度。以每孔80μg蛋白入10％SDS-PAGE凝膠電泳后，4℃、50V下濕式電轉(zhuǎn)移儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入PVDF膜。5％脫脂奶粉封閉液封閉2h，一抗[抗Bim(1：200)，抗p-Akt(1：300)]稀釋，4℃孵育膜過夜，相應(yīng)二抗(1：1500)室溫孵育膜2h，DAB顯色，觀察拍照，進(jìn)行灰度值測定。實驗重復(fù)3次以上。 4、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析，P<0.05有

9、統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、Bim蛋白在各組病變中的表達(dá)。 免疫組化結(jié)果顯示，Bim蛋白在乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變及浸潤性導(dǎo)管癌組織中陽性表達(dá)率逐漸降低，在乳腺普通導(dǎo)管增生與重度不典型增生及原位癌組間、重度不典型增生及原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌組間陽性表達(dá)率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026：P=0.014)。 2、乳腺癌組織中Bim表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系。 在47例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，Bim蛋白表達(dá)與

10、患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系，但與組織學(xué)分級有關(guān)(P=0.033)，且組織學(xué)分級越低，Bim蛋白陽性表達(dá)率越低。 3．Bim蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。 Western印跡法檢測結(jié)果顯示，低轉(zhuǎn)移的MCF-7細(xì)胞中Bim蛋白的表達(dá)高于高轉(zhuǎn)移的MDA-MB-231細(xì)胞。 4、用LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路后乳腺癌細(xì)胞Bim蛋白表達(dá)的變化。 將不同濃度的LY294002(0、10、25、5

11、0μmol/L)加入培養(yǎng)液后24h，用Western印跡法檢測顯示，乳腺癌細(xì)胞MCF-7中p-Akt蛋白水平下降，Bim蛋白表達(dá)水平升高。 結(jié)論： 1、Bim蛋白在正常乳腺導(dǎo)管、乳腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變及乳腺癌中的表達(dá)呈遞減趨勢。 2、Bim蛋白的表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級有關(guān)，組織學(xué)分化程度越低，蛋白陽性表達(dá)率越低。 3、在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，LY294002阻斷PI3K/Akt通路，使p-Akt表達(dá)水平下降