Bim蛋白在乳腺癌中的表達及其與PI3K-Akt通路的關系.pdf

1、目的： Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)是Bcl-2家族BH3-only亞家族的成員，是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白。Bim廣泛表達于正常細胞，其中包括造血細胞，上皮細胞，神經(jīng)細胞以及生殖細胞。PI3K/Akt信號通路參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、增生、分化和代謝等一系列生理活動，現(xiàn)有許多研究表明PI3K/Akt信號通路異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。研究證實，不同的生長因子刺激后，PKB

2、/Akt磷酸化forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子，改變其胞內(nèi)定位。在沒有PKB/Akt作用的情況下，forkhead家族主要定位于核內(nèi)，通過結合到特異順式作用元件促進Fas-L、IGFBP1和Bim等凋亡相關基因的轉(zhuǎn)錄。近有報道，在Ba/F3細胞，激活的Akt可以直接磷酸化BimEL的Ser87位點，促進其的泛素化和降解。本科研組的前期工作發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt-Bad通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，Bim、Bad同屬于BH3-onl

3、y亞家族，那么在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，Bim是否扮演著同樣重要的角色，這對指導乳腺癌的臨床診斷和治療有重要意義。 材料和方法： 1、材料 (1)臨床資料：101例乳腺組織取自中國醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院，為2001-2005年手術切除標本。依據(jù)WHO乳腺腫瘤組織學分類標準(2003)進行組織學分級，其中乳腺正常組織15例，普通導管增生病變組織12例，乳腺導管輕中度不典型增生病變組織10例，重度不典型增生及導管原位癌

4、病變組織17例，乳腺浸潤性導管癌病變組織47例。 (2)細胞系：人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞系購自協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心。細胞分別在37℃、5％CO<,2>、含10％胎牛血清的DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細胞鋪滿瓶底時棄去培養(yǎng)液，0.25％胰蛋白酶消化傳代。 2、試劑 第一抗體分別為兔抗人Bim多克隆抗體(購買自Neomarkers公司)和兔抗人p-Akt1/2/3(Ser473)多

5、克隆抗體(購自Santa Cruz公司)。PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002購自Cell Signaling公司。免疫組化染色過程采用的即用型S-P試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。WesternBlotting用二抗及兔抗人多克隆anti-β-actin抗體(PR-0255)均購自中山生物技術有限公司。DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)基購白購自Gibco公司。 3、方法 (1)免疫

6、組化(S-P)法：①步驟：按鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)法試劑盒說明書步驟行免疫組織化學染色。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。②結果判定：以細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為Bim表達陽性細胞。鏡下選擇10個高倍視野的1000個腫瘤細胞，根據(jù)陽性細胞的百分率分為四個等級：0分無陽性細胞；1分陽性細胞>30％；2分陽性細胞30％～70％；3分陽性細胞>70％。按染色強度將其也分為個等級：0分無陽性細胞；1分陽性細胞

7、染色呈淺黃色；2分陽性細胞染色呈黃色；3分陽性細胞染色呈棕黃色。陽性細胞數(shù)評分與染色強度評分相加后除以2得出綜合評分。綜合評分≥2分為陽性表達。 (2)Western印跡法：待細胞至90％融合狀態(tài)時，冰冷的PBS沖洗細胞兩次，加入0.25％胰蛋白酶消化，收集細胞。在收集的細胞內(nèi)加入裂解液反復吹打，4℃靜置30min，離心提取上清為總蛋白。不同終濃度的LY294002(0、10、25、50μmol/L)處理MCF～7細胞24h后，

8、按上述方法提蛋白，用Bradford法測蛋白濃度。以每孔80μg蛋白入10％SDS-PAGE凝膠電泳后，4℃、50V下濕式電轉(zhuǎn)移儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入PVDF膜。5％脫脂奶粉封閉液封閉2h，一抗[抗Bim(1：200)，抗p-Akt(1：300)]稀釋，4℃孵育膜過夜，相應二抗(1：1500)室溫孵育膜2h，DAB顯色，觀察拍照，進行灰度值測定。實驗重復3次以上。 4、統(tǒng)計學分析應用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件進行分析，P<0.05有

9、統(tǒng)計學意義。 結果： 1、Bim蛋白在各組病變中的表達。 免疫組化結果顯示，Bim蛋白在乳腺導管內(nèi)增生性病變及浸潤性導管癌組織中陽性表達率逐漸降低，在乳腺普通導管增生與重度不典型增生及原位癌組間、重度不典型增生及原位癌和浸潤性導管癌組間陽性表達率差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.026：P=0.014)。 2、乳腺癌組織中Bim表達與臨床病理特征間的關系。 在47例乳腺浸潤性導管癌中，Bim蛋白表達與

10、患者的臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移無明顯關系，但與組織學分級有關(P=0.033)，且組織學分級越低，Bim蛋白陽性表達率越低。 3．Bim蛋白在乳腺癌細胞中的表達。 Western印跡法檢測結果顯示，低轉(zhuǎn)移的MCF-7細胞中Bim蛋白的表達高于高轉(zhuǎn)移的MDA-MB-231細胞。 4、用LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路后乳腺癌細胞Bim蛋白表達的變化。 將不同濃度的LY294002(0、10、25、5

11、0μmol/L)加入培養(yǎng)液后24h，用Western印跡法檢測顯示，乳腺癌細胞MCF-7中p-Akt蛋白水平下降，Bim蛋白表達水平升高。 結論： 1、Bim蛋白在正常乳腺導管、乳腺導管上皮內(nèi)瘤變及乳腺癌中的表達呈遞減趨勢。 2、Bim蛋白的表達與乳腺癌組織學分級有關，組織學分化程度越低，蛋白陽性表達率越低。 3、在乳腺癌細胞MCF-7中，LY294002阻斷PI3K/Akt通路，使p-Akt表達水平下降