線性鮭魚降鈣素類似物的合成及長效研究.pdf

1、降鈣素(Calcitonins)是一類含有32個氨基酸殘基的多肽激素，其主要作用是抑制骨吸收，降低血鈣水平。不同種屬的天然降鈣素都包括了如下的結(jié)構(gòu)特征：1) 1，7位半胱氨酸形成的二硫鍵結(jié)構(gòu)；2) C-末端的脯氨酰胺結(jié)構(gòu)；3) 8-22位的兩性a-螺旋結(jié)構(gòu)。天然降鈣素中以鮭魚降鈣素(sCT)和鰻魚降鈣素(eCT)，的活性較好，它們的合成類似物已在臨床上用于治療老年性骨質(zhì)疏松癥、Paget’s癥、高血鈣癥及骨痛等疾病。天然降鈣素在體內(nèi)代謝

2、穩(wěn)定性較差，體內(nèi)半衰期短(如sCT 的半衰期為14min)。大量文獻報道，以大分子聚合物對肽類及蛋白質(zhì)類藥物進行修飾，可提高其體內(nèi)代謝穩(wěn)定性。聚乙二醇(PEG)是一種較為廣泛應(yīng)用的大分子修飾劑，從1990年起，已有多種PEG修飾的蛋白質(zhì)類藥物上市。 本論文旨在已有的線性降鈣素研究基礎(chǔ)上，設(shè)計合成新的線性sCT 類似物，并對其進行定點的單PEG修飾，并從中尋找出生物活性高且代謝穩(wěn)定性好的sCT類似物。 根據(jù)文獻提供的s

3、CT 體內(nèi)/外代謝及構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果，以及前期得到的高活性線性sCT類似物，從兩個角度出發(fā)設(shè)計了系列新的sCT類似物：(1)序列較短且具有降鈣活性的類似物；(2)通過PEG定位修飾得到穩(wěn)定性更高，作用時間更長的降鈣素類藥物。主要設(shè)計思路包括：1)缺失19-22位氨基酸殘基或更多氨基酸殘基的類似物； 2)對高活性線性sCT類似物的易代謝位點或其附近的氨基酸以其它結(jié)構(gòu)相似的氨基酸殘基進行替換，或以半胱氨酸替換，并進行定點PEG修飾；3)對設(shè)

4、計合成的線性鮭魚降鈣素類似物及其PEG修飾物進行降鈣活性及其它相關(guān)生化指標的測定。總結(jié)構(gòu)效關(guān)系，指導(dǎo)下一步的設(shè)計。根據(jù)以上的設(shè)計思路，共合成了氨基酸殘基在20-32之間的sCT類似物12個。在肽序列的合成中，選用4-甲基二苯基甲胺樹脂(MBHA)為固相載體，采用芴甲氧羰基(Fmoc-)保護策略，HOBt/DCC為縮合劑，由C-末端向N-末端延長肽鏈。氨基酸側(cè)鏈功能團保護基以TFA脫除，以無水HF將肽鏈從樹脂上裂解下來。均經(jīng)反向高效液相色

5、譜(RP-HPLC)純化和基質(zhì)輔助激光解吸附離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)的鑒定。 PEG修飾劑可以針對肽鏈中不同的氨基酸殘基側(cè)鏈基團進行修飾：-NH<,2>，-COOH，-SH等。PEG化反應(yīng)中蛋白質(zhì)或多肽上的反應(yīng)官能團多呈親核性，其親核活性順序：巰基>a-氨基>e-氨基>羧基>羥基。多肽和蛋白質(zhì)通常含有多個可進行PEG化的氨基及巰基，sCT 中N-端a-氨基和Lys<'11>、Lys<'18>的e-氨基均可

6、同時發(fā)生PEG化。而利用巰基的高反應(yīng)活性，在肽鏈易代謝位點或其附近引入一個Cys，并選取能夠特異性與巰基偶聯(lián)的PEG修飾劑mPEG-MAL，可實現(xiàn)對sCT的定點修飾。PEG修飾產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC純化和MALDI-TOF-MS鑒定。 體內(nèi)的降鈣活性測定結(jié)果表明，線性sCT序列中的氨基酸殘基以半胱氨酸替換后未見活性喪失，以D-Ala同時取代Cys<'1>和Gly<'30> 后活性略有增強。初步長效研究發(fā)現(xiàn)，PEG修飾產(chǎn)物LK-Y