長(zhǎng)效卵泡刺激素類似物的制備及性質(zhì)研究.pdf

1、學(xué)校代碼：10385分類號(hào)：研究生學(xué)號(hào)：1300203055密級(jí)：長(zhǎng)效長(zhǎng)效卵泡刺激素類似物的制備及性質(zhì)研究卵泡刺激素類似物的制備及性質(zhì)研究PreparationpropertiesstudyoflongactingFolliclestimulatinghmoneanalog作者姓名：蔡冰指導(dǎo)教師：刁勇刁勇教授教授學(xué)科：微生物學(xué)微生物學(xué)研究方向：蛋白蛋白藥物藥物所在學(xué)院：生物生物醫(yī)學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)學(xué)院論文提交日期：二0一六年三月二十五年三月二十

2、五日摘要I摘要卵泡刺激素(FollicleStimulatingHmoneFSH)是一種哺乳動(dòng)物的垂體分泌的促性腺激素，其化學(xué)本質(zhì)是糖蛋白，在動(dòng)物生殖過程中扮演了十分重要的角色。應(yīng)用于動(dòng)物中除了促進(jìn)家畜提早發(fā)情外，更多的是作為胚胎移植技術(shù)中超數(shù)排卵的關(guān)鍵激素。國(guó)內(nèi)目前使用的FSH制劑主要從動(dòng)物垂體中取得，能夠促進(jìn)動(dòng)物超排，但仍存在一些局限性。首先是存在攜帶病毒的危險(xiǎn)，且來源有限，此外，天然的FSH半衰期短，施用外源性FSH促進(jìn)動(dòng)物超排需

3、要每日注射1~2次，并連續(xù)注射4~5天，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。其次，在動(dòng)物體內(nèi)FSH的血液藥物濃度在閾值窗內(nèi)即可發(fā)揮其生理作用，過高的藥物濃度并不必要?；贔SH的結(jié)構(gòu)以及生理作用，本課題組將天然的以共價(jià)鍵結(jié)合的FSHα亞基和β亞基用一段多肽序列連接，并使用CHOK1細(xì)胞為工程細(xì)胞，培養(yǎng)得到單鏈蛋白形式的FSH長(zhǎng)效類似物。我們制備的FSH類似物具有良好的生物活性，可以促進(jìn)大鼠卵巢增重，半衰期也顯著增加，單次注射可達(dá)到果納芬8次的注射效果。

4、本文對(duì)得到的CHOFSH細(xì)胞進(jìn)行篩選以及大規(guī)模培養(yǎng)，并探索了FSH類似物的純化工藝。（1）本文采用有限稀釋法單克隆培養(yǎng)CHOFSH細(xì)胞，獲得培養(yǎng)液上清進(jìn)行WesternBlotting鑒定和ELISA分析，篩選得到高產(chǎn)細(xì)胞株。并將細(xì)胞聚集以及凍存，建立CHOFSH工作細(xì)胞庫(kù)，用于研究及生產(chǎn)。（2）為了得到大量FSH類似物蛋白，我們對(duì)CHOFSH細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，確定了大規(guī)模培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，并對(duì)細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶和發(fā)酵罐中的細(xì)胞增殖及FSH類似物的產(chǎn)

5、出進(jìn)行對(duì)比。（3）細(xì)胞的穩(wěn)定性，我們長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)CHOFSH細(xì)胞，并檢驗(yàn)培養(yǎng)獲得FSH類似物的產(chǎn)量以及生物活性，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)下細(xì)胞具有穩(wěn)定性，產(chǎn)出FSH類似物均在2.7μgml左右，而生物效價(jià)維持在11500IUml上下。（4）在CHOFSH細(xì)胞的培養(yǎng)液上清中含有多種蛋白，本文初步探究了蛋白的純化工藝，以嘗試得到純度較高的FSH類似物蛋白。利用等電點(diǎn)沉淀、染料親和層析對(duì)培養(yǎng)液上清進(jìn)行純化，并通過WesternBlotting鑒定層析洗脫