長效卵泡刺激素類似物的制備及藥效學研究.pdf

1、卵泡刺激素,又稱促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH),是腦垂體分泌的可刺激卵泡的發(fā)育成熟以及精子形成的一種糖蛋白激素。其活性形式為由α亞基和β亞基形成的異源二聚體。在臨床上,卵泡刺激素主要用于治療不孕不育癥,以及在輔助生殖技術(Assisted Reproductive Technology,ART)中作為超數(shù)排卵的關鍵藥物。目前臨床應用的卵泡刺激素制劑,或由尿液中提取,或基因重組技術得到。FS

2、H制劑雖在臨床具有很好的療效,但仍存在一些局限性。首先是半衰期比較短,患者需要在生殖期連續(xù)注射一周左右且每天1-2次皮下注射,病人的用藥依從性非常差。其次,FSH的有效性并不依賴于過高的藥物濃度,而在于維持藥物濃度在FSH閾值內窗口內的能力。所以,可長期維持FSH血藥濃度在治療窗內的長效FSH的研究成為臨床應用的迫切需求。
　　本文采用單鏈融合技術,將FSHβ亞基與α亞基通過含有兩個N-糖基化位點的多肽序列(氨基酸序列GSGSNA

3、TGSGSNATSGSTS)融合,得到具有FSH生物學活性的單鏈蛋白,即FSH類似物。將該單鏈蛋白的基因序列克隆至表達載體pcDNA3.1(+)中,利用Lipofectamine2000轉染CHO-K1細胞,并通過G418加壓,篩選得到CHO-FSH單克隆細胞系。將該單克隆細胞系進行擴大培養(yǎng),并采用無血清馴化懸浮培養(yǎng),成功建立可穩(wěn)定表達長效重組 FSH類似物(recombinant FSH analog,rFSH analog)的CHO

4、-FSH細胞系。rFSH類似物表達量最大可達3mg/L。
　　為了得到純度較高的rFSH類似物,論文初步探究了rFSH類似物的蛋白純化工藝。利用疏水凝膠層析、G-25凝膠層析以及DEAE陰離子凝膠層析色譜,對CHO-FSH上清液進行純化,通過SDS-PAGE與Western Blotting等方法進行鑒定與分析,初步確定了rFSH類似物蛋白的純化工藝。
　　本文采用經典的卵巢增重及超數(shù)排卵實驗,對rFSH類似物的生物活性進行

5、了檢測。實驗結果表明:①我們表達得到的rFSH類似物蛋白具有較好的生物活性,單次注射即可顯著性促進大鼠卵巢的增重,藥效與8次注射對比藥物(市售藥物Gonal-F)相當,說明rFSH類似物的體內藥效具有長效性特點。②rFSH類似物可較好的促進小鼠超數(shù)排卵,且超排效果與常用超排藥物孕馬血清(PMSG)相當。
　　本論文采用單鏈融合技術,將FSHβ亞基和α亞基融合為單鏈蛋白。利用CHO細胞生產得到了rFSH類似物,建立了rFSH類似物的