非編碼RNA在大鼠嚴(yán)重燙傷后早期脛骨前肌消耗中的表達(dá)譜變化及其生物信息學(xué)分析.pdf

1、研究背景:
　　進(jìn)入二十一世紀(jì)以來,人類對(duì)于編碼RNA的研究已經(jīng)較為深入,但對(duì)于完全解決疾病來講還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。隨著非編碼RNA進(jìn)入人們的視野,這類以往被認(rèn)為無任何作用的“暗物質(zhì)”給大家?guī)砹恕绑@喜”。它們通過直接或間接調(diào)控編碼RNA,影響基因、蛋白質(zhì)的功能,從而發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。近年來,隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,利用高通量生物芯片技術(shù)研究疾病的病因、診斷、治療,已經(jīng)成為一種新型的研究方法,在臨床與基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。我科

2、以往研究發(fā)現(xiàn):嚴(yán)重?zé)齻蟾叽x表現(xiàn)為骨骼肌消耗,而且脛骨前肌消耗較為顯著,且發(fā)現(xiàn)燙傷后大鼠在第3天開始即出現(xiàn)脛骨前肌消耗,7天最為明顯,在蛋白水平、基因水平和信號(hào)通路方面進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解、骨骼肌細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等是燒傷后骨骼肌消耗的重要原因。但略顯不足的是,在非編碼RNA的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方面的機(jī)制尚未進(jìn)行研究。
　　目的:
　　本研究擬通過高通量芯片篩選嚴(yán)重燙傷大鼠早期脛骨前肌非編碼RNA表達(dá)

3、譜的改變,應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法,深入挖掘芯片數(shù)據(jù)提供的信息,發(fā)現(xiàn)其可能的致病機(jī)制,為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和途徑。本課題擬進(jìn)行以下三部分研究:
　　(1)觀察嚴(yán)重燙傷早期大鼠脛骨前肌消耗改變
　　(2)篩選大鼠嚴(yán)重燙傷早期脛骨前肌微小RNA表達(dá)譜并進(jìn)行生物信息學(xué)分析
　　(3)篩選嚴(yán)重燙傷大鼠早期脛骨前肌長鏈非編碼RNA表達(dá)譜并進(jìn)行生物信息學(xué)分析
　　方法:
　　(1)采用雄性Wistar大鼠制備燙傷大鼠模

4、型,實(shí)驗(yàn)組大鼠采用94℃熱水、12s造成大鼠背部30％TBSA三度燙傷,對(duì)照組大鼠采用37℃溫水(其余條件同實(shí)驗(yàn)組)。分別于傷后1d、3d、7d、14 d(n=8)麻醉處死大鼠,分離獲取脛骨前肌,稱量肌肉重量。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)法測(cè)定脛骨前肌細(xì)胞凋亡。同時(shí)留取脛骨前肌標(biāo)本用于微小RNA和長鏈非編碼RNA的檢測(cè)。
　　(2)采用丹麥鎖核苷酸技術(shù)Exiqon miRCURY? LNA microRNA芯片(第七代),約7

5、00條捕獲探針,數(shù)據(jù)庫版本為v18.0,檢測(cè)(1)中留取的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中傷后3天的脛骨前肌標(biāo)本(n=4),對(duì)部分差異microRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證以檢驗(yàn)芯片數(shù)據(jù)的可靠性;對(duì)篩選出的部分差異 microRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、聚類分析、基因功能分析(GO analysis)、信號(hào)通路分析(Pathway)等生物信息學(xué)分析,對(duì)部分。
　　(3)采用Arraystar公司Rat LncRNA Array(4x44K, Arr

6、aystar)大鼠長鏈非編碼RNA芯片,設(shè)計(jì)包括LncRNAs和蛋白編碼基因,約來自于NCBI RefSeq數(shù)據(jù)庫的9000個(gè)lncRNAs和UCSC數(shù)據(jù)庫的約15000個(gè)mRNA。檢測(cè)(1)留取的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中傷后3天的脛骨前肌標(biāo)本(n=3),對(duì)部分差異LncRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證以檢驗(yàn)芯片數(shù)據(jù)的可靠性;對(duì)篩選出的差異 LncRNAs進(jìn)行基因功能分析(GO analysis)、信號(hào)通路分析(Pathway)、CNC網(wǎng)絡(luò)分析等

7、生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　(1)在相同時(shí)間點(diǎn)和對(duì)照組相比,脛骨前肌重量及其與體重比值在嚴(yán)重燙傷大鼠傷后3d即出現(xiàn)下降,7d下降達(dá)到最低;體現(xiàn)出明顯的骨骼肌消耗狀態(tài)。傷后燙傷大鼠脛骨前肌細(xì)胞凋亡增加。
　　(2)燙傷組與對(duì)照組相比,共有69種miRNA呈現(xiàn)差異表達(dá),其中升高的miRNA有4種,降低的miRNA有65種;經(jīng)過GO分析顯示,參與代謝過程相關(guān)的miRNA包括6種,參與生物調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA包括5種。P

8、ATHWAY分析顯示關(guān)系密切的研究通路有P53信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等。
　　(3)長鏈非編碼RNA芯片數(shù)據(jù)顯示,從約15000個(gè)大鼠mRNAs中檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異mRNAs,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,顯著升高的共有93個(gè),而降低的則有110個(gè)。從約9000個(gè)大鼠 lncRNAs中檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異lncRNAs,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,升高的共有64個(gè),而降低的則有53個(gè),且倍數(shù)大于1

9、.5(P<0.05)。GO分析顯示生物過程的負(fù)調(diào)控、補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑、電壓門控氯離子通道活性等多種功能與長鏈非編碼RNA相關(guān)。PATHWAY分析顯示胰島素信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等信號(hào)通路可能受到長鏈非編碼RNA調(diào)控。
　　結(jié)論:
　　(1)大鼠嚴(yán)重燙傷后早期脛骨前肌microRNAs表達(dá)譜產(chǎn)生改變,且生物信息學(xué)分析 microRNAs可能主要參與了調(diào)控代謝過程、生物調(diào)節(jié)等多種功能,并參與 P53信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路