烏司他丁抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后復發(fā)的實驗研究.pdf

1、結(jié)腸癌的預后主要與有無遠處轉(zhuǎn)移尤其是肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移多為分化型腺癌，轉(zhuǎn)移灶常較局限，常不伴其它轉(zhuǎn)移，因而有較高的切除率。大量的臨床研究表明，積極徹底的肝切除是結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移病人獲得長期存活甚至治愈的唯一手段。然而手術(shù)只能切除肉眼可見的、大的轉(zhuǎn)移灶，并不能清除原來已存于肝內(nèi)的微小轉(zhuǎn)移灶，有80％~90%病例術(shù)后兩年內(nèi)復發(fā)，其中40%病例轉(zhuǎn)移灶僅出現(xiàn)在肝臟。這與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶所處的特殊微環(huán)境密切相關(guān)?；谥委熞饬x的外科手術(shù)，在肝部

2、分切除之后，由于肝臟的損傷，啟動了肝再生機制，同時對于那些術(shù)中未被發(fā)覺而殘留于肝內(nèi)的微小癌細胞灶，在客觀上也創(chuàng)造了一個加速生長的生物學環(huán)境。我們在前期工作中也發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后可誘發(fā)肝內(nèi)微小殘留灶的進展，方式是肝再生過程中釋放的生長因子通過旁分泌機制促進腫瘤細胞的生長。因此，針對觸發(fā)隱性轉(zhuǎn)移灶進展的發(fā)生機制尋找有效的藥物，是提高結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的生存率的關(guān)鍵。腫瘤細胞的浸潤生長必然包括細胞對細胞外基質(zhì)的降解?；|(zhì)金屬蛋白酶（Matr

3、ix metalloproteinases, MMPs）是鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶在各種病理條件下，包括炎癥性疾病，腫瘤細胞的浸潤和血管生成中所涉及的，可以降解細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）蛋白從而進行組織重塑的過程中。以往的研究表明在肝切除術(shù)后肝臟分泌MMPs，特別是MMP-2和MMP-9。在晚期肝再生期間，基質(zhì)金屬蛋白酶活性的影響相關(guān)細胞外基質(zhì)的分解和重構(gòu)。重塑過程可能提供腫瘤細胞植入腳手架。因此，我們推

4、測，切除誘導蛋白酶升高有助于在肝臟轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的增長。MMP-9的調(diào)節(jié)主要通過基因轉(zhuǎn)錄、酶原激活及MMP-9的生理性抑制物（Tissue inhibitor of Metalloproteinase,TIMP）3個水平實現(xiàn)。大多數(shù)的MMPs在細胞組織中處于靜息狀態(tài)時不表達，只有當細胞組織發(fā)揮生理功能或處于病理狀態(tài)下才表達，以無活性的酶原形式分泌到細胞外，通過與尿激酶型纖維酶原激活物（urinaryplasminogen activato

5、r,UPA）和纖溶酶結(jié)合到細胞表面而被激活，選擇性地與ECM成分結(jié)合。大量實驗報道，Interleukin(IL)-1α和纖溶酶原（plasminogen）一起作用能促進MMP-9前體轉(zhuǎn)換成活性狀態(tài)MMP-9，所以本實驗使用IL-1α和纖溶酶原作為陽性對照。烏司他丁，作為尿激酶抑制劑（Ulinastatin,UTI）類似物，是一種在人的尿液和血液中發(fā)現(xiàn)的Kunutz型廣譜絲氨酸酶蛋白酶抑制劑。烏司他丁能抑制多種絲氨酸酶，例如胰蛋白酶，胰

6、凝乳蛋白酶，中性粒細胞彈性蛋白酶，血纖維蛋白溶酶和纖溶酶?；趶V譜的蛋白酶抑制作用，烏司他丁被認為是一種天然的抗炎調(diào)節(jié)因子。在臨床上，烏司他丁被廣泛的應用于胰腺炎、急性循環(huán)障礙和圍手術(shù)期血液穩(wěn)定的調(diào)節(jié)等的治療作用。除了其抗炎作用外，已有報道烏司他丁能夠抑制腫瘤體外和腫瘤轉(zhuǎn)移小鼠模型中的侵襲和轉(zhuǎn)移。絲氨酸蛋白酶降解多種細胞外基質(zhì)成分，同時激活了一些基質(zhì)金屬蛋白酶，其中包括MMP-9。因此，我們探討烏司他丁是否通過其抗纖溶酶活性作用，從而有

7、效降低結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后的復發(fā)率。
　　目的：⑴通過體外實驗，觀察烏司他丁對結(jié)腸癌細胞侵襲能力、MMP-9及纖溶酶活性的影響，探討烏司他丁抑制結(jié)腸癌細胞侵襲的作用機制。⑵建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后裸鼠模型，觀察烏司他丁對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后殘肝腫瘤生長情況、癌細胞增殖反應以及MMP-9表達的影響，為指導烏司他丁在預防結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后復發(fā)的臨床應用提供可靠的藥理學依據(jù)及最佳用藥時機，為干預結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移術(shù)后復發(fā)的發(fā)生和發(fā)展提供有效

8、的治療手段及合理治療方案。
　　方法：①Transwell細胞體外侵襲實驗檢測UTI對結(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響。②明膠酶譜法檢測UTI對MMP-9活性的影響。③ELISA法檢測UTI對纖溶酶表達量的影響。④結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立：選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pRC/CMV2-luc+真核表達質(zhì)粒的HCT-116結(jié)腸癌細胞制成細胞懸液，接種裸鼠脾臟被膜下，脾表面以75%乙醇棉棒壓迫止血和殺滅可能外滲的癌細胞，防止腹腔內(nèi)種植轉(zhuǎn)移。將脾臟放回原位,關(guān)腹

9、。⑤腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移檢測：利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pRC/CMV2-luc+真核表達質(zhì)粒的HCT-116結(jié)腸癌細胞表達的熒光素標記，利用生物活體成像技術(shù)觀察結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移祼鼠模型腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。腫瘤種植后2周出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，遂行左肝葉切除。⑥結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移肝切除術(shù)后轉(zhuǎn)移率檢測：肝切除術(shù)后21天處死動物，肝臟被取出并固定于10%中性甲醛中，選擇靠近手術(shù)切面的肝臟邊緣部分石蠟包埋，再選取大小大致相同的腫瘤組織部分，做成1.5mm厚的連續(xù)切片，等間隔選取切片，每份

10、標本至少選取15張，HE染色，采用體視學定量分析技術(shù)（Quantitative stereological analysis）檢測結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移率。⑦細胞增殖反應（Ki-67）和MMP-9表達量檢測：選擇靠近手術(shù)切面的肝臟邊緣部分石蠟包埋，再選取大小大致相同的腫瘤組織部分，做成1.5mm厚的連續(xù)切片，等間隔選取切片，免疫組化檢測Ki-67和MMP-9表達量。⑧統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，運用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，

11、計量資料用單因素方差分析，用Mann-Whitney U檢比較組間的體視學定量分析，用LSD檢驗及進行組間均值比較進行組間均值比較。差異P<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：⑴UTI抑制結(jié)腸癌細胞侵襲能力：Transwell細胞體外侵襲實驗結(jié)果表明：GM6001組的侵襲抑制能力最強，其次為 H-UTI組、 L-UTI組、IL-1α+plasminogen+H-UIT組、IL-1α+plasminogen+L-UIT組、生理鹽水對

12、照組、IL-1α+plasminogen組（P<0.05）。表明IL-1α通過纖溶酶原激活物/纖溶酶系統(tǒng)介導而活化MMP-9活性，進而促進細胞侵襲，加入UTI后則能抑制其侵襲能力。⑵UTI對MMP-9活性的影響：明膠酶譜法是檢測MMP-9活性的經(jīng)典方法。結(jié)果顯示：①IL-1α+plasminogen組與其它各組比較，MMP-9表達的活性最高（P<0.05），表明IL-1α可通過纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)激活更多基礎(chǔ)水平的pro-MMP9活化。

13、剩下各組的MMP-9活性依次為生理鹽水對照組、IL-1α+plasminogen+L-UTI組、IL-1α+plasminogen+H-UTI組、L-UTI組、H-UTI組、MMP-9廣譜抑制劑組。②IL-1α+plasminogen+H-UTI組與IL-1α+plasminogen+L-UTI組兩組比較，前者的MMP-9表達水平較低（P<0.05）； H-UTI組與L-UTI組兩組比較，前者的MMP-9表達水平較低（P<0.05）；均

14、表明UTI通過抑制可溶性的纖溶酶原而抑制MMP-9活性，且濃度升高作用更強。⑶UTI對纖溶酶表達量的影響： IL-1α+plasminogen組與其它各組比較，纖溶酶的活性最高（P<0.05），依次為生理鹽水對照組、IL-1α+plasminogen+L-UTI組、IL-1α+plasminogen+H-UTI組、L-UTI組、H-UTI組（P<0.05）。其順序與明膠酶譜結(jié)果一致。表明UTI抑制MMP-9前體活化的作用機制是通過抑制纖

15、溶酶表達來實現(xiàn)。⑷結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型肝轉(zhuǎn)移率情況：利用活體成像技術(shù)觀察結(jié)腸癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞種植2周后，35只裸鼠中33只發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，表明結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的成瘤率較高。遂行左肝葉切除術(shù)后，隨機將其分為三組分別予以治療。肝切除術(shù)后21天處死裸鼠，其病理結(jié)果顯示：結(jié)節(jié)型肝癌10例（30.31%），彌漫性肝癌15例（45.45%），混合型肝癌8例（24.24%）。⑸UTI對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移肝切除術(shù)后復發(fā)的影響：體視學定量分析技術(shù)檢

16、測早期治療組、晚期治療組及生理鹽水對照組的腫瘤轉(zhuǎn)移率分別為41.64%±6.56%、35.18%±7.22%、48.91%±7.40%(P<0.05)，表明UTI抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移肝切除術(shù)后轉(zhuǎn)移。使用UTI的最佳時期可能是肝切除術(shù)后一周左右。⑹UTI對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移肝切除術(shù)后腫瘤細胞增殖反應的影響：免疫組化檢測Ki-67標志，從而反映腫瘤細胞增殖水平。結(jié)果顯示：早期治療組、晚期治療組及生理鹽水對照組的Ki-67陽性表達分別為：4.56±1.

17、02、3.62±1.11、5.97±0.72，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑺UTI對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移肝切除術(shù)后腫瘤組織中MMP-9水平的影響：早期治療組、晚期治療組及生理鹽水對照組的MMP-9陽性表達分別為：5.55±0.96、4.71±0.99、6.27±0.89，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。早期治療組、晚期治療組 MMP-9水平均低于生理鹽水對照組，晚期治療組最低。提示烏司他丁通過抑制腫瘤組織MMP-9的活化，從而抑制結(jié)腸癌

18、細胞的侵襲。
　　結(jié)論：①UTI通過纖溶酶原激活物/纖溶酶系統(tǒng)抑制MMP-9的活化，且濃度升高作用更強。②UTI可有效降低結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型肝部分切除術(shù)后殘余腫瘤的復發(fā)，且以術(shù)后一周開始用藥為佳。然而，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后復發(fā)是一個多步聚、多途徑的過程，涉及多個基因和蛋白的相互協(xié)同和拮抗作用。單純針對MMPs藥物并不能完全抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移術(shù)后復發(fā)的發(fā)生，深入理解復發(fā)環(huán)節(jié)的分子機制，尋找治療靶點，是針對性臨床試驗開展的基礎(chǔ)。另一方