玉米ZmCIPK23的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、CBL(calcineurin B-like protein)是近些年來發(fā)現(xiàn)的植物所特有的一類鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白，與其靶蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)相互作用一起在植物應(yīng)答逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期通過同源克隆得到ZmCIPK23序列。發(fā)現(xiàn)其與ZmCBL1,4,5,9具有相互作用。根據(jù)擬南芥中的AtCIPK23的功能，推測(cè)其可能與低鉀響應(yīng)有關(guān)。但在低鉀脅迫下Z

2、mCIPK23的表達(dá)及其功能并不清楚。因此本研究是以玉米的“鄭單958”為實(shí)驗(yàn)材料，利用生物信息學(xué)及半定量RT-PCR的方法，對(duì)玉米的ZmCIPK23及4個(gè)ZmCBLs基因在低鉀脅迫，外源脫落酸及茉莉酸處理下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并克隆了ZmCIPK23的啟動(dòng)子，構(gòu)建了Pro-ZmCIPK23與 PCAMBIA1391的融合表達(dá)載體，此外還克隆了 ZmCIPK23基因的全長(zhǎng)，構(gòu)建了 ZmCIPK23與pRI-101的過表達(dá)載體，為其功能研

3、究奠定基礎(chǔ)。目前已獲得如下結(jié)果：
　　（1）分別對(duì)長(zhǎng)至五葉期的玉米幼苗進(jìn)行低鉀脅迫處理，對(duì)長(zhǎng)至兩葉一心期的玉米幼苗進(jìn)行外源ABA及JA的處理，設(shè)計(jì)ZmCIPK23和4個(gè)ZmCBLs的特異性引物，采用半定量RT-PCR對(duì)低鉀、ABA及JA處理下ZmCIPK23和ZmCBLs的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ZmCIPK23及4個(gè)ZmCBLs基因在葉片和根中的表達(dá)模式是不同的。低鉀脅迫下，ZmCIPK23在葉片和根中的表達(dá)量都在8天時(shí)達(dá)到最大值

4、。葉片中，ZmCBL1及ZmCBL9的表達(dá)基本上沒有變化，整體而言 ZmCBL4，5的表達(dá)量較低。根中ZmCBL1,4,5,9的表達(dá)量也是在8天時(shí)達(dá)到最大值。ABA處理下ZmCIPK23在葉片和根中都是從2h開始表達(dá)量顯著地升高，6h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值。JA處理下ZmCIPK23在葉片中是從3h開始表達(dá)量顯著地升高，6h時(shí)表達(dá)量下降，之后表達(dá)量又升高。在根中，ZmCIPK23的表達(dá)量從12h開始顯著地升高，24h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值。Zm

5、CBL1,4,5,9在ABA及JA的處理下表達(dá)量變化沒有低鉀脅迫明顯。結(jié)果表明它們均被不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)且低鉀脅迫下的表達(dá)差異最為顯著。
　?。?）為了進(jìn)一步明確ZmCIPK23的表達(dá)情況，設(shè)計(jì)特異性引物，以玉米的gDNA為模版，PCR擴(kuò)增得到1228bp長(zhǎng)的ZmCIPK235，端上游的啟動(dòng)子片段。順式作用元件預(yù)測(cè)分析表明該基因啟動(dòng)子區(qū)域具有熱響應(yīng)、光響應(yīng)、激素相關(guān)、細(xì)胞周期調(diào)控、發(fā)育相關(guān)及其它功能未知的調(diào)控結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步構(gòu)建Pr

6、o-ZmCIPK23與 PCAMBIA1391的融合表達(dá)載體，經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證，表明重組的融合載體構(gòu)建成功。為進(jìn)一步通過啟動(dòng)子活性分析ZmCIPK23的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。
　　（3）設(shè)計(jì)特異性引物，以玉米的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到1350bp的ZmCIPK23全長(zhǎng)。利用在線工具（http://www.plantgdb.org/）分析得知ZmCIPK23基因含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子；蛋白結(jié)構(gòu)分析，表明ZmCIP