磁性溫敏凝膠作為卡介苗載體在膀胱腫瘤灌注治療中的應用研究.pdf

1、研究背景:
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高。膀胱癌包括尿路上皮癌、鱗狀細胞癌和腺細胞癌，其中尿路上皮癌最為常見，雖然理論上經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術可完全切除非肌層浸潤性膀胱癌，但術后復發(fā)率可高達67％。因此中國、歐洲及美國的泌尿外科指南建議所有非肌層浸潤性膀胱癌患者術后均應進行輔助性膀胱灌注治療?？ń槊纾˙acillus Calmette-Guérin，BCG）是膀胱灌注常用的一種生物制劑，為一種減毒活菌，具有一

2、定的抗原性、致敏性和殘余毒性。經(jīng)過多年的實踐，BCG已被公認為最有效的預防膀胱腫瘤復發(fā)的免疫制劑，適用于表淺的、非肌層浸潤性膀胱腫瘤的術后灌注治療。
　　BCG膀胱灌注雖然療效確切，但其不良反應發(fā)生率較高，限制了其臨床應用。且有研究報道，30～50％的膀胱腫瘤病人BCG灌注失敗，因無法耐受副作用、對BCG治療反應差、腫瘤進展或復發(fā)等，最終停用BCG灌注治療。增加BCG的灌注劑量是增強BCG治療反應的最直接方法，但矛盾的是BCG灌注

3、的劑量越大，雖然抗腫瘤效果明顯，但副作用隨之增加，如何提高BCG的療效同時降低其不良反應，成為研究的熱點。
　　由于人周期性的排尿，藥物灌注后很快隨尿液排出體外，其與膀胱粘膜的作用時間較短，通常只有1～2小時。藥物膀胱內(nèi)灌注后，在較短的時間段內(nèi)，病人對膀胱內(nèi)藥物的反應個體差異較大，部分病人甚至沒有反應。膀胱內(nèi)藥物灌注的效果主要與膀胱內(nèi)藥物濃度及持續(xù)時間相關，而非藥物灌注劑量。因此，BCG灌注后在膀胱內(nèi)的持續(xù)作用時間對治療效果至關重

4、要。
　　基于殼聚糖(CS)及β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate，GP)的溫敏凝膠是一種生物材料，在室溫條件下，CS和GP的混合溶液呈液態(tài)，加熱至37℃體溫條件下，即轉變?yōu)镃S/GP凝膠。CS凝膠在藥物載體、細胞包裹及組織工程等方面得到廣泛應用，是優(yōu)良且極具發(fā)展前途的醫(yī)用緩釋體系。因此我們設想，CS/GP溫敏凝膠可以裝載BCG進行膀胱灌注，以期延長BCG在膀胱內(nèi)的滯留時間，提高BCG的療效。
　　CS/GP

5、溫敏凝膠載體進入膀胱后依然會隨尿液排出體外。我們設想利用磁性顆粒及外加磁場防止凝膠載體隨尿液排出。Fe3O4磁性納米粒(Fe3O4 magnetic nanoparticle，F(xiàn)e3O4-MNP)是一種納米級鐵氧體，具有磁響應性好，在液體中可均勻分散，且在生物體內(nèi)可被降解，無毒副作用等特性，作為磁性材料在生物領域中得到廣泛應用。因此我們將Fe3O4-MNP包裝進入CS/GP溫敏凝膠內(nèi)，在外加磁場條件下，利用Fe3O4-MNP所提供的磁牽

6、引力，實現(xiàn)凝膠載體在膀胱內(nèi)的貼壁粘附。
　　研究目的:
　　本課題中我們以CS/GP凝膠為基質(zhì)，設計了一種搭載BCG、Fe3O4-MNP的載體復合物（Fe3O4-BCG-CS/GP），在常溫條件下為液體，進入體內(nèi)后可轉變?yōu)槟z，用以進行BCG的膀胱灌注，以期延長BCG在膀胱內(nèi)的作用時間，并最終增強BCG的抗膀胱腫瘤作用。
　　方法:
　　1.Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)的構建、表征檢測及體內(nèi)應用可行

7、性評估
　　1.1、Fe3O4-BCG-CS/GP載體復合物的制備
　　根據(jù)已有文獻報道及我們的前期實驗，制備方法如下:
　　1)將脫乙酰度為95％的CS溶于0.1mol/L的稀鹽酸中;
　　2)室溫下持續(xù)充分攪拌2小時;
　　3)將CS溶液中不溶性顆粒過濾;
　　4)將β-GP粉末溶于蒸餾水中;
　　5)將CS溶液及β-GP溶液在4℃冰箱中冷藏10分鐘;
　　6)持續(xù)攪拌的狀態(tài)下將β-G

8、P溶液逐滴加入CS溶液中，直至形成均一的溶液;
　　7)然后將一定量的BCG及Fe3O4-MNP加入混合溶液中，采用機械攪拌、超聲分散的方法混合均勻;
　　1.2、CS/GP溶液及Fe3O4-BCG-CS/GP復合物溶液的體外凝膠化時間測定
　　不同濃度配比的CS/GP溶液及Fe3O4-BCG-CS/GP載體復合物凝膠化時間的測定按照如下經(jīng)典方法進行:
　　將溶液加入離心管中;37℃水浴鍋中加熱;按照一定的時間間

9、隔，從水浴鍋中取出離心管，倒置觀察;倒置30s樣品不流動，即可認為凝膠化完成;記錄不同CS和GP配比的CS/GP溶液凝膠化時間，F(xiàn)e3O4-BCG-CS/GP載體復合物溶液凝膠化時間同理測定。
　　1.3、大鼠體內(nèi)凝膠化時間測定及冰凍切片檢查
　　利用大鼠測定體內(nèi)凝膠化時間。灌注前，進行腹腔注射麻醉，取3Fr硬膜外導管自制大鼠導尿管。用空針抽出大鼠膀胱內(nèi)尿液。將0.1mlFe3O4-BCG-CS/GP載體復合物溶液注入大鼠膀

10、胱內(nèi)。根據(jù)步驟2中測定的凝膠化時間，處死大鼠，取出膀胱，觀察凝膠化完成情況。然后對大鼠膀胱進行冰凍切片檢查，觀察復合物凝膠后的形態(tài)。
　　1.4、數(shù)碼顯微鏡及掃描電鏡檢查
　　我們采用數(shù)碼顯微鏡及掃描電鏡來觀察Fe3O4-BCG-CS/GP復合物凝膠的表面形態(tài)。Fe3O4-BCG-CS/GP復合物溶液在37℃水浴中完成凝膠化。取樣品少量冷凍干燥。放置于數(shù)碼顯微鏡下觀察攝片。噴鍍貴金屬銀，增強導電性，處理完成后在掃描電鏡下觀察

11、復合物凝膠的表面形態(tài)。
　　1.5Fe3O4-BCG-CS/GP復合物凝膠大鼠膀胱內(nèi)滯留時間測定
　　雌性Wistar大鼠36只用以測定Fe3O4-BCG-CS/GP復合物凝膠在膀胱內(nèi)的滯留時間。大鼠膀胱灌注前2小時禁飲。麻醉后進行膀胱灌注，所有大鼠處于4kG外加磁場中飼養(yǎng)。灌注后每4小時處死大鼠3只;取膀胱標本立即進行冰凍切片檢查，HE染色觀察膀胱內(nèi)殘留凝膠形態(tài)，抗酸染色及復染HE染色觀察凝膠中剩余BCG的形態(tài)。
　

12、　2.Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)抗膀胱腫瘤作用的研究
　　2.1、實驗設計
　　本部分實驗使用24只雌性Wistar大鼠。根據(jù)以往成熟的實驗設計，采用BBN誘發(fā)大鼠膀胱腫瘤原位模型后進行抗腫瘤實驗。BBN加入每日飲水中，濃度為0.05％，共喂養(yǎng)8周。10周后，24只大鼠根據(jù)灌注藥物的不同隨機分為4組:
　　第一組(Group1):為對照組，給予0.1ml的PBS灌注;
　　第二組(Group2):

13、給予1mg/0.1ml的BCG進行膀胱灌注;
　　第三組(Group3):CS/GP溶液灌注組，每次灌注0.1ml;
　　第四組(Group4):給予Fe3O4-BCG-CS/GP復合物溶液0.1ml，含1mgBCG。
　　四組大鼠每周灌注一次，共6次。實驗的1～8周為腫瘤誘導期，11～16周為治療期。四組大鼠均飼養(yǎng)于強度為4kG的磁場環(huán)境中。
　　2.2、抗腫瘤效果驗證
　　20周后麻醉下處死所有大鼠，收

14、集大鼠膀胱組織觀察。詳細記錄每只大鼠的腫瘤數(shù)目及每個腫瘤的體積，計算每組大鼠的腫瘤發(fā)生率及每只大鼠的平均腫瘤體積。直徑超過0.5mm的腫物擬定為腫瘤，列入統(tǒng)計中。腫瘤體積按如下公式計算:V(mm3)=1/2×a×b2（a是腫瘤的最大直徑，b為腫瘤的最短直徑）。
　　2.3、尿液細胞因子分析
　　膀胱灌注后，將4組大鼠轉移至代謝籠內(nèi)收集尿液。第一次膀胱灌注后24小時收集尿液，每日收集1次，共6次。按實驗計劃，在處死大鼠前收集尿

15、液1次。每次收集的時間約2小時。收集尿液的離心管內(nèi)含蛋白酶抑制劑，收集時放置于冰塊上。收集完成后離心、儲存于-80℃冰箱中待檢。本實驗采用雙抗體夾心ELISA法來檢測大鼠尿液中IL-2和IFN-γ的濃度，描繪出其變化曲線。通過計算曲線下面積(area under the curve，AUC)來估算大鼠接受單次膀胱灌注后尿液中細胞因子分泌的總量，據(jù)此評估大鼠膀胱內(nèi)免疫反應的強弱。
　　2.4、免疫組化檢查
　　大鼠膀胱灌注BC

16、G后引起膀胱內(nèi)CD4+的淋巴細胞浸潤，其在BCG抗膀胱腫瘤的作用機制中起重要作用。處死所有大鼠后，收集大鼠膀胱組織進行免疫組化檢查。我們采用CD4抗體免疫組化染色的方法檢測膀胱粘膜中浸潤的CD4+淋巴細胞。
　　2.5、統(tǒng)計分析
　　所有數(shù)據(jù)讀取等檢測步驟重復進行三遍，指標進行統(tǒng)計學處理，采用Prism5統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)值以(x)±s表示，根據(jù)需要選用配對資料的t檢驗或單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，選用雙側檢驗。P＜0

17、.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)的構建、表征檢測及體內(nèi)應用可行性評估
　　實驗所制備的CS/GP溶液無色半透明狀，性質(zhì)均一，在體外加熱至37℃的條件下，CS/GP溶液成功完成凝膠化，凝膠化后溶液失去流動性。傾倒離心管，凝膠固定不流動。Fe3O4-BCG-CS/GP復合物成功完成凝膠化，樣品呈灰黑色，性質(zhì)均一。實驗發(fā)現(xiàn)，CS及GP的濃度皆可影響凝膠化時間。由于復合

18、物凝膠中Fe3O4-MNP的存在，凝膠保留了一定的磁響應性。經(jīng)冰凍切片、HE染色后觀察，F(xiàn)e3O4-BCG-CS/GP載體復合物亦在大鼠膀胱內(nèi)完成凝膠化。由于CS為有機物，冰凍切片法較好地保留了復合物凝膠在膀胱內(nèi)的形態(tài)，顯示Fe3O4-BCG-CS/GP復合物凝膠載體呈網(wǎng)格狀的微結構，大小、直徑不一。數(shù)碼顯微鏡及電鏡下可觀察到復合物凝膠的表面同樣呈現(xiàn)大小不同的網(wǎng)格狀結構，與冰凍切片所示結構相似。在磁場作用下，復合物凝膠在膀胱內(nèi)貼附到膀胱

19、壁表面。隨著復合物凝膠在膀胱內(nèi)作用時間的延長，其在粘膜表面的降解增多、隨尿液排出的損耗增大以及尿液的溶蝕作用，其濃度和密度也逐漸降低，凝膠網(wǎng)格溶脹擴大，網(wǎng)格壁變薄。經(jīng)過48小時，我們?nèi)钥稍诎螂變?nèi)檢測到少量凝膠存留，因此我們可以認為，磁性凝膠作為BCG載體，可以在外加磁場的作用下，在膀胱內(nèi)滯留時間長達48個小時。
　　2.Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)抗膀胱腫瘤作用的研究
　　在抗大鼠膀胱腫瘤的研究中，大鼠灌注Fe

20、3O4-BCG-CS/GP復合物后，所有24只大鼠均按計劃完成20周的實驗過程。在第20周末，處死大鼠，取大鼠膀胱組織進行檢查。Fe3O4-BCG-CS/GP復合物與普通BCG都顯示出明顯抗腫瘤誘導作用。Fe3O4-BCG-CS/GP復合物組大鼠的平均腫瘤體積較BCG組大鼠明顯減小，但在腫瘤數(shù)目方面的差異沒有統(tǒng)計學意義。Fe3O4-BCG-CS/GP復合物灌注后大鼠尿液中IL-2及IFN-γ濃度較普通BCG組明顯升高，且分泌總量較大。通

21、過CD4染色，F(xiàn)e3O4-BCG-CS/GP復合物灌注的大鼠膀胱粘膜下有更多CD4+淋巴細胞浸潤。
　　結論：
　　本實驗中成功制備了以CS/GP溫敏凝膠為載體、以Fe3O4-MNP為磁性牽引物、搭載BCG的Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)，經(jīng)驗證可在體內(nèi)、體外成功完成凝膠化，保留了較好的磁響應性。凝膠載體呈網(wǎng)格狀，BCG等搭載物在凝膠載體中相對獨立，利于BCG的釋放。Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)在外

22、加磁場作用下，可在大鼠膀胱內(nèi)延長BCG的作用時間達48小時;動物實驗顯示，與普通BCG相比，同等劑量條件下Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體所搭載的BCG可刺激膀胱分泌更多細胞因子，募集大量炎性細胞浸潤，在膀胱內(nèi)產(chǎn)生更強的粘膜免疫反應，其抗膀胱腫瘤作用優(yōu)于普通BCG。我們認為以CS/GP溫敏凝膠為載體搭載Fe3O4-MNP、BCG后構建的Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)，增強了BCG的免疫活性及抗腫瘤效應，為BCG的應用提