富含亮氨酸的三角狀五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)自噬的調(diào)節(jié)及其機(jī)制的研究.pdf

1、腫瘤是是目前致死率最高的疾病之一，它是由非正常和不可控的一類(lèi)細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）形成，隨著生長(zhǎng)腫瘤會(huì)逐漸侵犯正常組織以及產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最終造成機(jī)體功能的損害。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不僅受多種基因的調(diào)控，而且與機(jī)體內(nèi)許多生理功能如自噬、凋亡、應(yīng)激等密切相關(guān)。近年來(lái)，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及術(shù)后預(yù)后過(guò)程中發(fā)揮的重要作用受到了高度的關(guān)注。自噬是指細(xì)胞降解受損細(xì)胞器如線粒體、核糖體或細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)周期蛋白質(zhì)的一種重要生理過(guò)程，為維持細(xì)胞的穩(wěn)

2、定起著重要的作用。線粒體自噬是自噬的類(lèi)型之一，可維持線粒體的穩(wěn)態(tài)。自噬在腫瘤中的作用與細(xì)胞所處的微環(huán)境有關(guān)，所處微環(huán)境不同自噬在腫瘤細(xì)胞中的作用可能完全相反：自噬的抑制不僅會(huì)造成細(xì)胞DNA穩(wěn)定性降低，而且可減少非正常細(xì)胞的死亡，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生；腫瘤細(xì)胞所處環(huán)境發(fā)生變化時(shí)（缺乏營(yíng)養(yǎng)、缺氧、能量不足等），自噬可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器及蛋白的降解速率來(lái)維持腫瘤細(xì)胞生存。
　　研究發(fā)現(xiàn)定位于線粒體內(nèi)膜的富含亮氨酸的三角狀五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)蛋白（Le

3、ucine-rich pentatricopeptide repeat-containing protein，LRPPRC）在肺腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌以及淋巴瘤中高表達(dá)。它在腫瘤中表達(dá)情況與前列腺癌、胃癌、卵巢癌等腫瘤的分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。更為重要的是，LRPPRC在腫瘤中表達(dá)越高，患者術(shù)后5年生存率以及10年生存率越低。除了與腫瘤的關(guān)系，LRPPRC與自噬也有著密切聯(lián)系。LRPPRC與自噬重要調(diào)節(jié)蛋白

4、MAP1S可以形成穩(wěn)定復(fù)合物，并且有學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)RPPRC可能參與到了自噬以及線粒體自噬的過(guò)程中。
　　本課題研究的目的是明確LRPPRC在自噬過(guò)程中發(fā)揮的基本生物功能，以及LRPPRC在自噬中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中使用HeLa、COS7、HEK-293T三種細(xì)胞系，研究LRPPRC蛋白水平的變化對(duì)自噬以及線粒體自噬水平的影響。并且著重分析了LRPPRC對(duì)維持線粒體穩(wěn)定所起的作用、LRPPRC對(duì)線粒體自噬調(diào)節(jié)通路PINK1/Park

5、in的影響以及LRPPRC在對(duì)自噬激活起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中的效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)LRPPRC作為一種定位在線粒體內(nèi)膜上的蛋白，能參與自噬以及線粒體自噬調(diào)節(jié)過(guò)程，對(duì)維持機(jī)體和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起重要調(diào)節(jié)作用。這為以后研究LRPPRC在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及術(shù)后預(yù)后過(guò)程中所起作用的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　第1部分 LRPPRC對(duì)基礎(chǔ)自噬水平的影響
　　目的：探討LRPPRC表達(dá)水平被下調(diào)或上調(diào)后對(duì)基礎(chǔ)自噬水

6、平的影響。
　　方法：篩選并培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的HeLa細(xì)胞（HeLa-GFP-LC3細(xì)胞）。在HeLa、HEK-293T和HeLa-GFP-LC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LRPPRC siRAN抑制細(xì)胞LRPPRC表達(dá)含量，并在COS7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染入GFP-LRPPRC質(zhì)粒使細(xì)胞內(nèi)LRPPRC過(guò)表達(dá)。應(yīng)用電子顯微鏡掃描比較轉(zhuǎn)染LRPPRC siRAN與轉(zhuǎn)染Control siRAN的HeLa細(xì)胞中的自噬空泡。使用NH4Cl（20nM）或

7、者BAF（10nM）作為溶酶體抑制劑，抑制自噬小體降解。采用免疫印跡、免疫熒光方法檢測(cè)當(dāng)細(xì)胞LRPPRC蛋白水平改變以及在有或無(wú)溶酶體抑制的條件各HeLa、HEK-293T和HeLa-GFP-LC3細(xì)胞中自噬標(biāo)記物L(fēng)C3、P62、GFP-LC3的表達(dá)量和COS7細(xì)胞中LC3的蛋白含量。
　　結(jié)果：HeLa、HEK-293T、HeLa-GFP-LC3細(xì)胞中LRPPRC水平下降均導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)LC3、P62、GFP-LC3蛋白水平降低，且

8、HeLa-GFP-LC3細(xì)胞中GFP-LC3熒光點(diǎn)減少。但是在加入溶酶體抑制劑后LRPPRC水平下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)LC3、P62、GFP-LC3升高明顯且高于LRPPRC表達(dá)正常的細(xì)胞，GFP-LC3熒光點(diǎn)聚集并呈斑塊狀也明顯多于LRPPRC表達(dá)正常的細(xì)胞。用電子透射顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞中自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬空泡在抑制LRPPRC后下降，但是同時(shí)使用溶酶體抑制劑后明顯高于LRPPRC未被抑制的細(xì)胞。COS7細(xì)胞中LRPPRC蛋白水平的增

9、高使細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)含量增高，但加入溶酶體抑制劑后細(xì)胞中LC3的蛋白水平低于LRPPRC表達(dá)正常的細(xì)胞。
　　結(jié)論：LRPPRC被抑制細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平提高、LRPPRC過(guò)表達(dá)時(shí)基礎(chǔ)自噬水平降低。LRPPRC抑制時(shí)不僅能通過(guò)促進(jìn)自噬小體的生成，而且可以促進(jìn)自噬小體的降解速率。
　　第2部分LRPPRC對(duì)線粒體自噬的影響
　　目的：研究LRPPRC表達(dá)被抑制后細(xì)胞中線粒體以及線粒體自噬的改變情況。
　　方法：在He

10、La細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LRPPRC siRAN抑制細(xì)胞LRPPRC表達(dá)含量。利用Mitotracker對(duì)細(xì)胞線粒體染色以及免疫熒光對(duì)cytochrome c染色的方法比較正常細(xì)胞與LRPPRC表達(dá)抑制HeLa細(xì)胞中線粒體電位情況。使用Tom20標(biāo)記線粒體，并采用免疫熒光、免疫印跡方法比較有或無(wú)溶酶體處理的正常HeLa細(xì)胞、LRPPRC表達(dá)抑制HeLa細(xì)胞中線粒體總量。還應(yīng)用免疫熒光雙染色法對(duì)比研究有或無(wú)溶酶體處理的HeLa-GFP-LC3細(xì)胞、

11、LRPPRC表達(dá)抑制的HeLa-GFP-LC3細(xì)胞中，Tom20標(biāo)記的線粒體與LAMP1/2標(biāo)記的溶酶體或LC3標(biāo)記的自噬小體的共定位情況。
　　結(jié)果：LRPPRC被抑制表達(dá)后，HeLa細(xì)胞內(nèi) Mitotracker熒光減弱、cytochrome c熒光與免疫印跡檢測(cè)的蛋白含量均下降。未使用溶酶體抑制劑時(shí)，LRPPRC抑制細(xì)胞中Tom20標(biāo)記的線粒體與GFP-LC3的共定位、Tom20的總量都比正常細(xì)胞少。在使用了溶酶體抑制劑后，

12、LRPPRC被抑制細(xì)胞中Tom20標(biāo)記的線粒體與GFP-LC3的共定位比LRPPRC未被抑制的細(xì)胞多，且兩種細(xì)胞中Tom20的總量相同。在使用了溶酶體抑制劑后，LRPPRC被抑制細(xì)胞中Tom20標(biāo)記的線粒體與LAMP1/2標(biāo)記的溶酶體或LC3標(biāo)記的自噬小體的共定位均多于LRPPRC未被抑制的細(xì)胞。
　　結(jié)論：LRPPRC可以維持線粒體電位穩(wěn)定，并且抑制LRPPRC的表達(dá)導(dǎo)致線粒體自噬的激活。
　　第3部分LRPPRC在線粒體

13、自噬中調(diào)節(jié)機(jī)制的研究
　　目的：研究LRPPRC在線粒體自噬過(guò)程中發(fā)揮的作用，以及LRPPRC與線粒體自噬調(diào)節(jié)信號(hào)通路PINK1/Parkin間的相互關(guān)系。
　　方法：采用CCCP（10μM）或6-OHDA（100μM）處理細(xì)胞，建立線粒體自噬的細(xì)胞模型。HEK-293T細(xì)胞在CCCP或6-OHDA處理后，應(yīng)用免疫印跡方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)有或無(wú)溶酶體抑制劑處理的細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白ATG5-12、LC3、Bcl-2、P27以及L

14、RPPRC的蛋白水平，并通過(guò)電子顯微鏡觀測(cè)這些細(xì)胞中線粒體的形態(tài)與數(shù)量。利用免疫共沉淀方法對(duì)比檢測(cè)HEK-293T細(xì)胞有或無(wú)CCCP處理時(shí)細(xì)胞中內(nèi)源性LRPPRC與內(nèi)源性Parkin的相互關(guān)系。并且在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-Parkin質(zhì)粒后，通過(guò)免疫熒光雙染法與免疫共沉淀方法對(duì)比檢測(cè)有或無(wú)CCCP處理的細(xì)胞中內(nèi)源性LRPPRC與外源性GFP-Parkin的相互關(guān)系。在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RFP-LC3，并篩選穩(wěn)定表達(dá)（HeLa-RF

15、P-LC3）細(xì)胞株。為了明確LRPPRC在線粒體自噬中的作用使用CCCP處理轉(zhuǎn)染GFP-Parkin質(zhì)粒的HeLa-RFP-LC3細(xì)胞，采用免疫熒光方法觀察不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)細(xì)胞內(nèi)GFP-Parkin、LRPPRC、RFP-LC3、LAMP2標(biāo)記的溶酶體、Tom20標(biāo)記的線粒體之間的共定位現(xiàn)象。在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Parkin siRNA或HeLa細(xì)胞Parkin-GFP質(zhì)粒，以及在GFP-Parkin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中使用CC

16、CP處理不同時(shí)間，用免疫印跡的方法比較HEK-293T細(xì)胞、HeLa細(xì)胞中Parkin蛋白水平的變化對(duì)LRPPRC的影響以及比較表達(dá)Parkin-GFP與GFP的HeLa細(xì)胞中CCCP處理不同時(shí)間后Tom20、LRPPRC蛋白水平的變化。在HeLa細(xì)胞中采用轉(zhuǎn)染LRPPRC siRNA，或在COS7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-LRPPRC質(zhì)粒，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞中LRPPRC的水平。在過(guò)表達(dá)GFP-LRPPRC和GFP的細(xì)胞（對(duì)照細(xì)胞）內(nèi)加入蛋白合成抑

17、制劑CHX，以及在CHX處理不同時(shí)間后這兩種細(xì)胞中Parkin蛋白的變化。同樣，使用免疫印跡比較細(xì)胞中LRPPRC蛋白水平的變化后在有或無(wú) CCCP處理的細(xì)胞中線粒體蛋白 VDAC1、MFN-1、Drp1和Tom20、Parkin蛋白的蛋白含量，并采用免疫熒光的方法觀察轉(zhuǎn)染LRPPRC-GFP質(zhì)粒或GFP質(zhì)粒的COS7細(xì)胞在CCCP處理不同時(shí)間點(diǎn)線粒體形態(tài)的變化。
　　結(jié)果：CCCP或6-OHDA處理HEK-293T細(xì)胞后，LRP

18、PRC均在藥物作用較長(zhǎng)時(shí)間24h或12h才開(kāi)始逐漸降低，Tom20蛋白水平的降低落后于LRPPRC。在CCCP或6-OHDA處理前期ATG5-12、LC3蛋白表達(dá)增高，并在加入溶酶體抑制劑后有累積，但在較長(zhǎng)時(shí)間24h或12h后，ATG5-12、LC3蛋白表達(dá)含量在同時(shí)加入溶酶體抑制劑后仍不能夠增高。細(xì)胞中Bcl-2、P27隨著藥物使用時(shí)間延長(zhǎng)蛋白水平均下降。電鏡下觀察HEK-293T細(xì)胞在6h時(shí)細(xì)胞內(nèi)腫脹細(xì)胞增多，48h后即使加入溶酶體

19、抑制劑細(xì)胞內(nèi)仍不能發(fā)現(xiàn)完整線粒體。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示HEK-293T細(xì)胞中內(nèi)源性Parkin與LRPPRC，以及過(guò)表達(dá)GFP-Parkin質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中外源性Parkin與LRPPRC之間均存在相互結(jié)合現(xiàn)象，并且在CCCP處理2.5h后，Parkin與LRPPRC的結(jié)合率在兩種細(xì)胞中均增高。HeLa-RFP-LC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-Parkin及GFP質(zhì)粒后用在CCCP處理不同時(shí)間，在12h時(shí)Tom20、Parkin標(biāo)記的線粒體才開(kāi)

20、始與LC3標(biāo)記的自噬小體、LAMP2標(biāo)記的溶酶體有共定位，而這些與LC3、LAMP2結(jié)合的線粒體均是有LRPPRC缺失。HEK-293T細(xì)胞中Parkin的蛋白水平變化對(duì)LRPPRC沒(méi)有影響，HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GFP-Parkin也不影響LRPPRC的蛋白水平。但HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GFP-Parkin使細(xì)胞在CCCP的處理下LRPPRC和Tom20蛋白降低速度加快。HEK-293T細(xì)胞中LRPPRC被抑制后Parkin蛋白水平下降并

21、且過(guò)表達(dá)GFP-LRPPRC可以延長(zhǎng)COS7細(xì)胞中Parkin蛋白半衰期。在有或無(wú)使用CCCP處理的條件下LRPPRC降低后均可以促進(jìn)HEK-293T細(xì)胞中Parkin底物VDAC1、MFN-1、Drp1和Tom20蛋白水平降低速度。LRPPRC-GFP過(guò)表達(dá)的COS7比僅過(guò)表達(dá)GFP的COS7細(xì)胞的Parkin以及Tom20降低速度明顯減慢，且免疫熒光顯示GFP-LRPPRC表達(dá)的COS7細(xì)胞中線粒體熒光持續(xù)時(shí)間比僅表達(dá)GFP的細(xì)胞長(zhǎng)

22、。
　　結(jié)論：LRPPRC可以與Parkin相互結(jié)合，并且在線粒體自噬中Parkin從細(xì)胞胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體上后與LRPPRC結(jié)合，使得LRPPRC與Parkin結(jié)合增多并啟動(dòng)線粒體上相關(guān)蛋白通過(guò)溶酶體途徑降解。LRPPRC可以維持Parkin的穩(wěn)定性，并且抑制線粒體通過(guò)自噬降解。
　　第4部分 LRPPRC對(duì)自噬起始信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR的調(diào)節(jié)作用的研究
　　目的：明確LRPPRC與Bcl-2、Beclin

23、1、PI3KCIII之間的相互關(guān)系，以及LRPPRC在PI3K/Akt/mTOR通路激活過(guò)程中的作用。
　　方法：在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-Parkin和/或轉(zhuǎn)染LRPPRC siRNA后，用免疫印跡方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、LC3的蛋白水平。使用免疫印跡方法檢測(cè)轉(zhuǎn)入LRPPRC siRNA和/或P27 siRNA、LRPPRC siRNA和/或ATG5 siRNA以及三種 siRNA共同轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞在有或無(wú)使用溶

24、酶體抑制時(shí)，LRPPRC、ATG5、P27和LC3的蛋白水平變化。采用免疫印跡方法比較轉(zhuǎn)染LRPPRC siRNA和Control siRNA的HeLa細(xì)胞與HEK-293T細(xì)胞以及LRPPRC表達(dá)高的COS7細(xì)胞中Bcl-2、Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量。使用免疫共沉淀方法比較 LRPPRC抑制的HeLa細(xì)胞與 HEK-293T細(xì)胞中Bcl-2、Beclin1、PI3KCIII三種蛋白相互結(jié)合情況。
　　結(jié)果：LR

25、PPRC表達(dá)受抑制時(shí)細(xì)胞中Bcl-2、LC3蛋白水平均降低，同時(shí)過(guò)表達(dá)Parkin會(huì)使原本減低的Bcl-2、LC3蛋白水平有一定程度增高。LRPPRC抑制并加入溶酶體抑制時(shí)LC3增多，對(duì)細(xì)胞中ATG5、P27的蛋白水平無(wú)影響。加入溶酶體抑制后，抑制ATG5表達(dá)，LC3降低。同時(shí)抑制LRPPRC和ATG5的表達(dá)后，細(xì)胞中LC3也減低。同時(shí)抑制LRPPRC、ATG5、P27的表達(dá)后，細(xì)胞中LC3也減低明顯。HeLa細(xì)胞與HEK-293T細(xì)胞

26、LRPPRC表達(dá)抑制后相對(duì)于LRPPRC表達(dá)正常的細(xì)胞，僅有Bcl-2蛋白含量降低，Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量不變。COS7細(xì)胞LRPPRC表達(dá)增高后，也僅有Bcl-2蛋白含量降低，Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量不變。HeLa細(xì)胞與HEK-293T細(xì)胞中，LRPPRC與Bcl-2、Beclin1結(jié)合，不與PI3KCIII結(jié)合，并且當(dāng)LRPPRC被抑制后，LRPPRC Bcl-2、Beclin1結(jié)合下降，Bcl