線蟲(chóng)特異性富含甘氨酸的分泌肽的進(jìn)化擴(kuò)增.pdf

1、富含甘氨酸的蛋白根據(jù)總體結(jié)構(gòu)可以分為2類(lèi)：第一類(lèi)，由大量富含甘氨酸的蛋白質(zhì)組成(GRPs,>200 AA)，其具有超過(guò)200個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，典型的功能是作為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組件。第二類(lèi)，富含少量甘氨酸的分泌肽(GRSPs,<200 AA)，結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)典型的信號(hào)肽，緊跟信號(hào)肽后有一個(gè)成熟的富含甘氨酸的肽段。通過(guò)之前研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的動(dòng)物，植物和微生物的基因組中都有豐富的GPRs存在。在秀麗隱桿線蟲(chóng)先天免疫中，GRSPs家族的一些成員已被

2、證明發(fā)揮重要的作用，在線蟲(chóng)中GRSPs同樣重要。
　　目的：
　　我們對(duì)已發(fā)表的線蟲(chóng)GRSPs簇家族成員在免疫反應(yīng)中的作用十分感興趣，并且我們更有興趣知道與了解線蟲(chóng)中是否存在更多的GRSPs以及GRSPs如何響應(yīng)線蟲(chóng)感染這一過(guò)程的。GRSPs的全基因組鑒定會(huì)提供兩線蟲(chóng)整體的GRSPs進(jìn)化觀。而對(duì)線蟲(chóng)先天免疫公共轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行綜合分析將會(huì)使我們深入了解線蟲(chóng)GRSPs在先天免疫中的作用。
　　方法:
　　1.從UCS

3、C數(shù)據(jù)庫(kù)下載線蟲(chóng)C.elegans和C.briggsae全基因組蛋白序列，用于構(gòu)建兩線蟲(chóng)蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　2.以先前已報(bào)道發(fā)現(xiàn)的GRSPs nlp-29，NLP-31，nlp-33，cnc-2，cnc-4和cnc-6作為初始查詢(xún)對(duì)象，應(yīng)用NCBI中的Blastp與PSI-Blast對(duì)這些對(duì)象進(jìn)行分析。運(yùn)用線蟲(chóng)C.elegans局部蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)Local-Blastp對(duì)線蟲(chóng)GRSPs進(jìn)行序列分析以鑒定線蟲(chóng)GRSPs。

4、　　3.以C.elegans GRSPs作為查詢(xún)對(duì)象，應(yīng)用GenBank基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其它8個(gè)物種(包括H.sapiens，D.rerio，D.melanogaster，A.thaliana及D.discoideum)進(jìn)行查詢(xún)。
　　4.運(yùn)用信號(hào)肽預(yù)測(cè)服務(wù)器signal P4.0 server驗(yàn)證包含信號(hào)肽的GRSPs肽段。
　　5.運(yùn)用 NCBI中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù) GEO(Gene Expression Omnibus)與

5、DRASearch數(shù)據(jù)庫(kù)(https://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/)中的短片段 RNA測(cè)序項(xiàng)目(PRJNA33023)。
　　6.為了解GRSPs如何系統(tǒng)地對(duì)C.elegans感染并檢測(cè)線蟲(chóng)感染后可能共表達(dá)的GRSPs集簇，從 NCBI中的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載8個(gè)與線蟲(chóng)感染生物芯片定量相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE20053，E-MEXP-696，GSE27867，GSE54212，GSE53732，

6、GSE41058，GSE37266以及GSE2740)。同時(shí)，使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GEO2R工具對(duì)差異表達(dá)的目的基因進(jìn)行分析篩選。
　　7.兩線蟲(chóng) GRSPs信號(hào)肽序列通過(guò)應(yīng)用 EBI數(shù)據(jù)庫(kù)中多重序列比較的 Log-期望Muscle（multiple sequence comparison by log-expectation）對(duì)多序列比對(duì)進(jìn)一步分析。
　　8.利用程序分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析軟件包 MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)以通過(guò)檢

7、測(cè)基因重復(fù)情況來(lái)分析GRSPs家族的演變規(guī)律。
　　9.對(duì)線蟲(chóng)GRSPs蛋白質(zhì)亞家族I到亞家族X(qián)IV編碼序列，使用Clustal Omega多序列比對(duì)工具手動(dòng)調(diào)整參數(shù)分別進(jìn)行序列比對(duì)。
　　10.使用MEGA6應(yīng)用程序?qū)塑账嶂g的轉(zhuǎn)換（Ti）/顛換（Tv）的比值（R），同義替換(dS)與非同義替換(dN)的數(shù)量，基于密碼子的純化選擇Z-測(cè)試這些指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)從藻類(lèi)到哺乳動(dòng)物的人類(lèi)10個(gè)物

8、種全基因組的比較表明秀麗隱桿線蟲(chóng)（C.elegans）與線蟲(chóng)（C.briggsae）有著非常豐富的富含甘氨酸的分泌肽(GRSPs)，其中線蟲(chóng)C.elegans中有110種；線蟲(chóng)C.briggsae中有93種。
　　2.結(jié)果顯示大部分 GRSPs簇集在兩種線蟲(chóng)基因組[C.elegans中103種(93.64％)；C.briggsae中82種(88.17%)]，其中C.elegans又可以分為18個(gè)簇單元， C.briggsae則分為

9、13個(gè)簇單元。C.briggsae中除了有四個(gè)GRSPs簇在C.elegans中沒(méi)有匹配的簇外，在兩種線蟲(chóng)基因組中所有其它的GRSPs簇都具有成對(duì)的同源保守塊。
　　3.通過(guò)對(duì)生物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)定量分析后表明，線蟲(chóng)受到感染后，GRSPs簇在全基因組中廣泛的共表達(dá)。高度同源編碼序列和保守外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)顯示緊密的GRSPs簇可能來(lái)自局部DNA的復(fù)制。
　　4.純化選擇通過(guò)序列對(duì)和基于密碼子Z-test的總平均數(shù)直接進(jìn)行，顯示結(jié)

10、果值等于零.整體平均差(dS-dN)小于零，則說(shuō)明在兩種線蟲(chóng)GRSPs家族之間的發(fā)生了純化選擇。
　　結(jié)論：
　　GRSPs具有緊密結(jié)合的保守外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，其編碼的序列高度保守，并且可能來(lái)自局部 DNA復(fù)制。在基因組上共線性的 GRSPs簇在進(jìn)化上具有保守性，GRSPs簇的共表達(dá)以及強(qiáng)大的純化選擇可能說(shuō)明了C.elegans進(jìn)化的限制，以保證C.elegans能通過(guò)GRSPs簇全基因組共表達(dá)迅速應(yīng)對(duì)感染。
　　意

11、義:
　　在共線性的模塊之間基因組進(jìn)化上的保守性，線蟲(chóng)感染后GRSPs簇的共表達(dá)，以及編碼序列強(qiáng)烈的純化選擇，這些現(xiàn)象可能意味著對(duì)秀麗線蟲(chóng)進(jìn)化的限制，這用以保證秀麗隱桿線蟲(chóng)通過(guò)GRSPs簇的協(xié)同表達(dá)，協(xié)同調(diào)節(jié)和協(xié)同功能，從而通過(guò)免疫系統(tǒng)對(duì)感染進(jìn)行快速反應(yīng)，以抵御病原危害，這對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生存與繁衍至關(guān)重要。GRSPs蛋白家族對(duì)線蟲(chóng)免疫反應(yīng)至關(guān)重要，與其它物種相比，它們?cè)贑.elegans和C.briggsae中含量豐富。GRSP