地塞米松減少TDI所致的氣道上皮E-鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)破壞的影響.pdf

1、背景：支氣管哮喘（簡稱哮喘）是最常見的慢性呼吸道炎癥性疾病之一，研究顯示，全球哮喘病人約3億多，我國約有3000萬，而且仍有不斷增加的趨勢。盡管通過全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)推薦的規(guī)范化治療，大部分哮喘病人的臨床癥狀可得到有效控制，但并不能抑制疾病潛在的發(fā)展，因此探討哮喘的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步尋找治療靶點具有重要的意義。氣道上皮細(xì)胞(AEC)作為氣道抵御外來環(huán)境刺激的第一道防線，在維持氣道內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用，在哮喘氣道炎癥

2、的啟動和維持中扮演關(guān)鍵角色。雖然支氣管哮喘是以TH-2型炎癥為主的氣道慢性炎癥炎癥性疾病，但其疾病的進(jìn)程及對外界環(huán)境刺激因素的高度敏感卻不能單純從炎癥的角度來解釋。有研究表明:哮喘患者存在上皮屏障功能受損，在哮喘患者中氣道上皮細(xì)胞緊密連接及粘附連接蛋白的表達(dá)量較正常人減少，且與嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤有關(guān)。氣道上皮結(jié)構(gòu)及屏障功能的破壞，即上皮細(xì)胞間緊密連接等結(jié)構(gòu)蛋白的破壞可導(dǎo)致外界抗原輕易地通過氣道壁粘膜屏障，與粘膜下DC細(xì)胞等免疫細(xì)

3、胞接觸，從而誘發(fā)細(xì)胞因子、生長因子等炎癥因子釋放增加，通過與粘膜下間質(zhì)細(xì)胞相互作用，可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增生、氣道重塑，從而引起更強(qiáng)更持久的慢性炎癥反應(yīng)。職業(yè)性哮喘(Occupational Asthma)是工業(yè)化國家最常見的工作相關(guān)的肺疾病(Work-related lung disease)，其發(fā)病比例約占成人哮喘患者的15％。據(jù)統(tǒng)計，異氰酸鹽類是引起職業(yè)性哮喘最常見的原因，常見的異氰酸鹽包括甲苯二異氰酸鹽(Toluene Diisoc

4、yanate，TDI)、二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)、己二異氰酸酯(HDI)，其中，由于價格相對較低等優(yōu)勢，TDI的應(yīng)用最為廣泛，主要用于生產(chǎn)軟質(zhì)聚氨酯泡沫及聚氨酯彈性體、涂料、膠黏劑等，在建筑、家居、各種室內(nèi)外裝修中廣泛使用。長期暴露于TDI環(huán)境的人群，最終約有5％～15％發(fā)展為哮喘，而在普通人群中，哮喘的發(fā)病率約為0.1％～8％，我國約為0.11％～2.03％。鑒于其高發(fā)病率及所帶來的巨大社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，TDI所致的職業(yè)性哮喘已引

5、起高度重視，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制涉及免疫系統(tǒng)相關(guān)和非免疫系統(tǒng)相關(guān)等途徑，暴露人群中的基因易感性可能也參與了TDI哮喘的發(fā)病，但相關(guān)領(lǐng)域的機(jī)制研究還比較局限，許多方面還不清楚，因此進(jìn)一步研究其作用環(huán)節(jié)及尋找新的診斷、治療手段至關(guān)重要。
　　 TDI的結(jié)構(gòu)特點是含有活性很高的N=C=O基團(tuán)，使其成為一種反應(yīng)活性極強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，這一特點使其廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，同時這種高反應(yīng)性也使其具有較大毒性，也是導(dǎo)致職業(yè)性哮喘的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。TDI

6、作用與人體的重要靶點即氣道上皮細(xì)胞，其與AEC之間的相互作用在TDI哮喘的發(fā)病中具有重要地位。研究表明:氣道上皮單層的屏障結(jié)構(gòu)和其保護(hù)作用可以被異氰酸鹽所損壞，高濃度異氰酸鹽的暴露可以誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞固縮、DNA碎裂，緊密連接及縫隙連接蛋白解體、電阻改變甚至細(xì)胞的死亡。我們實驗室既往研究也表明:在體外試驗中，TDI-HSA復(fù)合物在不影響細(xì)胞活力的情況下，可引起氣道上皮細(xì)胞系(16HBE)細(xì)胞通透性的增加，該通透性的改變與血管內(nèi)皮生長因子

7、(VEGF)的釋放有關(guān)。但是TDI對于氣道緊密連接蛋白、粘附連接蛋白（E-鈣粘蛋白）等的影響并不清楚，在體內(nèi)TDI對于氣道屏障功能及氣道上皮細(xì)胞間連接蛋白的破壞作用也有待闡明。糖皮質(zhì)激素是目前哮喘治療的一線藥物，主要取決于其強(qiáng)大的抗炎作用，糖皮質(zhì)及素可以減輕炎癥細(xì)胞浸潤及抑制多種炎癥因子的表達(dá)，例如，它可以通過作用于氣道上皮細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體，抑制氣道上皮細(xì)胞釋放多種炎癥因子，近期研究亦表明糖皮質(zhì)激素可通過EGFR受體途徑作用與氣道上

8、皮細(xì)胞，引起正常狀態(tài)下氣道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1等重新分布，有增強(qiáng)上皮間屏障功能的作用。但是在損傷狀態(tài)下，糖皮質(zhì)激素是否具有上皮屏障修復(fù)作用尚不清楚。因此探討致敏狀態(tài)或損傷狀態(tài)下，糖皮質(zhì)激素對氣道上皮細(xì)胞屏障功能的保護(hù)作用非常重要和必要，這可能為糖皮質(zhì)激素運用于哮喘治療提供新的證據(jù)，同時為哮喘的治療找到新的治療靶點。本研究擬在前期體外實驗證明TDI-HSA可引起氣道上皮通透性增加的基礎(chǔ)上，在體內(nèi)外模型中探討TDI對氣道上皮E-鈣粘

9、蛋白的表達(dá)和分布變化，進(jìn)一步探討糖皮質(zhì)激素在其中的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。
　　 方法：⑴建立穩(wěn)定的TDI誘導(dǎo)的職業(yè)性哮喘小鼠模型。實驗分組:正常對照組（溶劑致敏，溶劑激發(fā)）、TDI哮喘組（TDI致敏，TDI激發(fā)）和地塞米松治療組（TDI致敏，TDI激發(fā)，激發(fā)前一天開始腹腔注射地塞米松，連續(xù)給藥8天）。觀察各組小鼠的一般狀態(tài)，是否出現(xiàn)哮喘癥狀及嚴(yán)重程度程度。⑵利用無創(chuàng)肺功能儀檢測各組小鼠氣道反應(yīng)性情況:使用不同濃度乙酰甲膽堿（

10、0，3.125，6.25，12.5，and25mg/ml溶解在0.9％生理鹽水中）激發(fā)，利用BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀檢測Penh值。⑶耳后淋巴結(jié)的培養(yǎng)，血清總IgE的測定:取小鼠耳后淋巴結(jié)，分離出淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)液上清檢測IL-4、IFN-γ。血清檢測總IgE水平。⑷小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞分類計數(shù): PBS灌洗，灌洗液離心沉淀細(xì)胞計數(shù)，蘇木素-伊紅(HE)染色進(jìn)一步行細(xì)胞分類計數(shù)。⑸小鼠肺臟組織的病理觀察:取出小鼠

11、肺組織，固定、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素—伊紅(HE)染色觀察小鼠肺臟病理變化。⑹取小鼠肺臟組織行免疫組化及western blotting檢測，觀察E-cadherin在氣道上皮的表達(dá)及分布情況。⑺制備TDI-HSA抗原結(jié)合物:應(yīng)用改良的Son M方法制備TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)。應(yīng)用Son et al.'s assay方法測定復(fù)合物中TDI及HSA結(jié)合比。⑻四唑鹽(MTT)比色法檢測不同濃度的TDI-HSA及HSA對

12、正常人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE-14o細(xì)胞活力的影響。分組情況:正常對照組（不加TDI-HSA，只以無血清培養(yǎng)基孵育），TDI-HSA20 ug/ml、TDI-HSA40 ug/ml、TDI-HSA60 ug/ml、TDI-HSA100 ug/ml, HSA20 ug/ml、HSA40 ug/ml、HSA60ug/ml、HSA100 ug/ml按上述分組刺激16HBE24h后，用MTT比色法檢測細(xì)胞活力。⑼觀察不同濃度TDI-HSA對

13、16-HBE E-鈣粘蛋白表達(dá)及分布的影響，分組情況:正常對照組（不加TDI-HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育），HSA對照組(HSA100ug/ml), TDI-HSA40ug/ml組，TDI-HSA60ug/ml組，TDI-HSA100ug/ml組，按上述分組刺激16HBE24小時后，行免疫熒光檢測不同濃度TDI-HSA刺激下氣道上皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白的分布情況、Western blotting檢測E-鈣粘蛋白總的表達(dá)水平。⑽觀察地塞米松及

14、ERK通路抑制劑對TDI-HSA所致的E-鈣粘蛋白破壞是否具有保護(hù)作用。實驗分組:正常對照組，HSA對照組(HSA100ug/ml)，TDI-HSA100ug/ml組，地塞米松預(yù)處理組（10-4M或10-6M），ERK通路抑制劑預(yù)處理組(PD9809510-7M)，地塞米松單獨刺激組(10-4M或10-6M)。地塞米松及ERK通路抑制劑均預(yù)處理細(xì)胞1小時。按上述分組刺激16HBE24小時后，分別行Western blotting及免疫熒

15、光檢測E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平及分布情況。⑾觀察TDI-HSA刺激下，16HBE ERK通路的活化情況及地塞米松對其干預(yù)作用。實驗分組:正常對照組（不加TDI-HSA，只以無血清培養(yǎng)基孵育），HSA100ug/ml組，TDI-HSA100ug/ml組，地塞米松預(yù)處理組(10-6M)，按上述刺激分組后，分別于刺激10分鐘及30分鐘時收取細(xì)胞，Western blotting檢測p-ERK及total-ERK水平。⑿統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS1

16、3.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊時,總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA)，各組間多重比較采用LSD法，方差不齊時總體均數(shù)的比較采用Welkch法，各組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗，以P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①TDI哮喘組小鼠在激發(fā)后可出現(xiàn)呼吸困難的臨床表現(xiàn)，地塞米松治療組小鼠的癥狀可部分緩解。隨著乙酰甲膽堿濃度上升，各組小鼠氣道反應(yīng)性檢測指標(biāo)Penh值

17、均出現(xiàn)上升趨勢。TDI哮喘組小鼠的氣道反應(yīng)性最高。12.5、25mg/ml乙酰甲膽堿激發(fā)時，TDI哮喘組Penh值與對照組相比，有顯著差異（P＜0.001，P＜0.001）。相對于TDI哮喘組，12.5及25mg/ml乙酰甲膽堿激發(fā)時，地塞米松治療組小鼠氣道反應(yīng)性明顯下降（P＜0.001,P=0.02）。②TDI哮喘組小鼠耳后淋巴結(jié)培養(yǎng)液中，IL-4及IFN-γ濃度較對照組明顯增高（P＜0.001，P＜0.001）。相對于TDI哮喘組，

18、地塞米松治療組IL-4及IFN-γ濃度顯著降低(P＜0.001，P=0.001)。TDI哮喘組血清總IgE水平與對照組相比顯著增高(P＜0.001)。相對于TDI哮喘組，地塞米松治療組可顯著降低血總IgE水平(P＜0.001)。③支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果:地塞米松可抑制TDI所致的支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞增加(P=0.031)，對總細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)及巨噬細(xì)胞數(shù)無明顯影響。相對于正常對照組組，TDI組小鼠BALF中性粒細(xì)

19、胞比例顯著增加(P=0.017)，地塞米松治療組進(jìn)一步顯著增加中性粒細(xì)胞比例(P=0.026)。小鼠肺組織病理可見:TDI組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤明顯增高，同時伴隨氣道上皮細(xì)胞的增殖及部分上皮的脫落。地塞米松可顯著抑制支氣管周圍及血管周圍的炎癥反應(yīng)。④免疫組化結(jié)果顯示:正常對照組小鼠，E-鈣粘蛋白多連續(xù)分布于氣道上皮細(xì)胞近管腔面，TDI組小鼠氣道上皮細(xì)胞間E-鈣粘蛋白分布顯著減少、排列紊亂、向胞漿內(nèi)彌散較多，在地塞米松治療組，TDI所致

20、的以上改變有部分恢復(fù)。⑤不同濃度TDI-HSA及不同濃度HSA對16HBE細(xì)胞活力的影響:TDI-HSA濃度為20 ug/ml、40 ug/ml、60 ug/ml、100 ug/ml及HSA濃度為20ug/ml、40 ug/ml、60 ug/ml、100 ug/ml時對細(xì)胞活力均無顯著影響(P=0.78)。⑥不同濃度TDI-HSA對16HBE E-鈣粘蛋白分布及表達(dá)的影響:免疫熒光顯示:在正常16HBE及單獨HSA處理細(xì)胞，E-鈣粘蛋白

21、多沿胞膜連續(xù)分布于細(xì)胞間連接處，不同濃度TDI-HSA(40ug/ml，60ug/ml，100ug/ml)處理24小時后，細(xì)胞間連接處E-鈣粘蛋白的完整性遭到破壞，向胞漿中彌散增多，且以上分布的改變呈濃度依賴趨勢。Western blotting檢測E-鈣粘蛋白總的表達(dá)水平，在各組間無顯著差異（P=0.99）。⑦地塞米松及ERK通路抑制劑對TDI-HSA所致E-鈣粘蛋白破壞的影響:相對于TDI-HSA處理組，地塞米松（10-4M，預(yù)處理

22、1小時）預(yù)處理組及ERK抑制劑（PD9809510-7M預(yù)處理1小時）預(yù)處理組，E-鈣粘蛋白的分布及結(jié)構(gòu)改變可部分被逆轉(zhuǎn)。Western blotting所見，各組E-鈣粘蛋白總表達(dá)量無明顯改變（P=0.79）。⑧TDI-HSA對ERK通路活化水平的影響及地塞米松對其干預(yù)作用:TDI-HSA100ug/ml刺激16HBE10分鐘及30分鐘，western blotting可見p-ERK水平顯著增加（P＜0.001，P=0.03），尤其以

23、10分鐘時作用最顯著。地塞米松預(yù)處理組（10-6M，預(yù)處理1小時）可顯著抑制TDI-HSA所誘導(dǎo)的p-ERK水平(刺激10分鐘時P=0.034，刺激30分鐘時P=0.025)。
　　 結(jié)論：⑴在TDI哮喘小鼠模型及16HBE細(xì)胞實驗均證明，TDI可顯著誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白分布的改變。但對E-鈣粘蛋白總的表達(dá)量無顯著影響。⑵TDI在動物模型及細(xì)胞水平均可誘導(dǎo)氣道上皮ERK通路的活化。體外ERK通路抑制劑(PD98095)可