雷公藤內(nèi)酯醇單獨以及聯(lián)合硼替佐米對人霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株L428的作用研究.pdf

1、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin'S Disease,HD)是起源于淋巴結(jié)和淋巴組織的惡性腫瘤,其發(fā)生大多與免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的某種細(xì)胞惡變有關(guān).它以在反應(yīng)性細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、組織細(xì)胞和纖維細(xì)胞的背景下,出現(xiàn)單核的霍奇金細(xì)胞(H)和多核的Reed.Sternberg細(xì)胞(RS)為特征.臨床上以無痛性淋巴結(jié)腫大為主要表現(xiàn),隨病變進(jìn)展向鄰近淋巴結(jié)區(qū)蔓延,還可出現(xiàn)局部及全身皮膚瘙癢.盡管部分霍奇金淋巴瘤被認(rèn)為是可以治愈的,

2、但是還存在一些復(fù)發(fā)患者以及難治性患者,需要考慮使用新藥來治療這些患者.雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide,TPL)是從傳統(tǒng)中藥衛(wèi)矛科雷公藤屬雷公藤中提取的活性成份,臨床已經(jīng)廣泛用于自身免疫性疾病,如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,腎炎,紅斑狼瘡等的治療.近年來的研究發(fā)現(xiàn)TPL還具有顯著的抗腫瘤作用,我們前期的實驗研究表明其對骨髓瘤細(xì)胞株亦有較好療效<'[1]>,但TPL對霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株的作用目前尚未見有報道.蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomi

3、b,PS-341,VELCADE)近年來在多發(fā)性骨髓瘤的治療中取得較好的療效,也用于非霍奇金淋巴瘤的治療,其機制主要通過下調(diào)核因子k B(NF k B)或者調(diào)控細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞凋亡通路而具有抗腫瘤作用<'[10,11,12]>,但是是否可用于霍奇金淋巴瘤的治療尚無報道以及相關(guān)的臨床資料.本實驗旨在進(jìn)一步研究TPL單獨以及聯(lián)合PS-341對霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株的作用并初步探討可能的作用機制,結(jié)合前人研究完善TPL對血液系統(tǒng)B細(xì)胞等惡性腫瘤

4、的作用研究,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù). [方法] 1.采用MTT比色法檢測TPL單獨以及聯(lián)合PS-341對霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株L428體外生長的抑制作用. 2.瑞氏一姬姆薩(Wright-Giemsa)染色,油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài). 3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀,Annexin V和PI雙染色,周期分析檢測細(xì)胞凋亡. 4.western-blot法檢測TPL單獨以及聯(lián)合PS-341對IA28細(xì)胞caspase3、9

5、,PARP,Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)水平的影響. [結(jié)果] 1.TPL、PS-341單獨以及聯(lián)合對L428細(xì)胞的生長的影響:MTT比色法檢測結(jié)果顯示,5-500ng/ml TPL處理L428細(xì)胞24h、48h、72h,細(xì)胞增殖明顯受抑制,各組間差異顯著(P值均小于0.001).且生長抑制率與藥物作用濃度呈正相關(guān)(P<0.001).TPL處理細(xì)胞24h、48h、72h后,L428的IC<,50>分別各為90

6、1.31ng/ml:12.13ng/ml:8.686ng/ml.當(dāng)采用5-500ng/ml的TPL聯(lián)合80ng/mlPS-341作用于L428細(xì)胞24小時,L428細(xì)胞生長明顯受抑制,IC<,50>降為7.246ng/ml,比TPL單藥作用增強124.56倍,其抑制效果明顯優(yōu)于單藥處理,細(xì)胞抑制率與藥物濃度呈正相關(guān). 2.TPL單獨與聯(lián)合PS-341對L428細(xì)胞凋亡的影響:采用瑞氏一姬姆薩染色,油鏡下觀察TPL作用前后L428

7、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,結(jié)果顯示,5～200ng/ml的TPL處理48小時后,L428細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征:細(xì)胞體積縮小,胞漿空泡化,細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊緣化,形成新月型核或環(huán)形核,細(xì)胞核碎裂,凋亡小體形成等.以流式細(xì)胞分析技術(shù)研究了細(xì)胞DNA含量、亞二倍體及磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位.L428細(xì)胞用0-200ng/ml TPL處理48小時,PI的DNA染色結(jié)果顯示亞二倍體凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(重復(fù)三次,以X4-SD表示)分別為:0.05﹪±0

8、.04,3.40﹪±1.18,4.69﹪±0.89,13.98﹪±0.69,15.68﹪±1.28.L428細(xì)胞分別用5ng/ml TPL、80ng/mlPS-34l處理24h,5ng/ml TPL聯(lián)合80ng/mlPS-341處理細(xì)胞24h,亞二倍體凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(重復(fù)三次,以X+SD表示)分別為0.02﹪±0,0.91﹪±1.14,4.89﹪±0.15,18.41﹪±3.84.細(xì)胞凋亡率與藥物作用濃度正相關(guān):r=0.782,P值小于

9、0.01.L428細(xì)胞用5-500ng/ml TPL處理細(xì)胞48h,AnnexinV-PI雙標(biāo)記法結(jié)果顯示早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(重復(fù)三次,以x±SD表示)分別為:4.86﹪±0.32,9.65﹪±0.40,11.19﹪±2.41,15.3﹪±1.18,23.24﹪±3.56(空白對照組為0.64﹪±0.21),細(xì)胞凋亡率與藥物作用濃度呈正相關(guān)(r=0.784,P<0.301);L428細(xì)胞用5ng/mlTPL、80ng/mlPS-341以

10、及用5ng/ml TPL聯(lián)合80ng/mlPS-341處理24h,早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(重復(fù)三次,以x±SD表示)分別為:3.47﹪±0.21,4.21﹪±0.57,10.68﹪±1.57(空白對照組為0.64﹪±0.21),細(xì)胞凋亡率與藥物作用濃度正相關(guān)(r=0.687,P<0.01). 3.TPL單獨以及聯(lián)合PS-341對L428細(xì)胞的caspase9,3、PARP、Bcl-2家族蛋白(BcL-2、Bax)表達(dá)水平的影響:

11、 5-200ng/ml TPL作用L428細(xì)胞48小時后,caspase9、3原始帶隨濃度的增加明顯下調(diào),而激活帶明顯上調(diào);PARP原始帶隨濃度的增加明顯下調(diào),而激活帶明顯上調(diào).Bcl-2表達(dá)水平隨藥物的濃度增加而顯著下調(diào),Bax表達(dá)水平則上調(diào),光密度掃描示Bcl-2的蛋白表達(dá)水平與TPL作用濃度存在負(fù)相關(guān),Bax的蛋白表達(dá)水平與TPL作用濃度呈正相關(guān).提示TPL可能通過線粒體途徑以及改變Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表

12、達(dá)比例,促使細(xì)胞色素C等多種凋亡因子的釋放誘導(dǎo)霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡.5ng/mlTPL聯(lián)合80ng/mlPS-341作用L428細(xì)胞24小時,caspase9、3原始帶在聯(lián)藥處理后明顯下調(diào),而激活帶明顯上調(diào);PARP原始帶在聯(lián)藥處理后明顯下調(diào),而激活帶明顯上調(diào).Bcl-2表達(dá)水平在聯(lián)藥處理后顯著下調(diào),Bax表達(dá)水平則上調(diào),提示TPL與PS-341可能協(xié)同通過線粒體途徑以及改變Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表達(dá)比例,促使細(xì)胞色

13、素C等多種凋亡因子的釋放誘導(dǎo)霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡. [小結(jié)] 1.在體外,TPL可抑制霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株L428細(xì)胞的生長,并呈濃度依賴性,聯(lián)合PS.341可以增強TPL對L428細(xì)胞的抑制作用; 2.5-500ng/ml TPL處理48h后可明顯誘導(dǎo)L428細(xì)胞的凋亡,并呈濃度依賴性,聯(lián)合PS-341可以增強TPL對L428細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡: 3.TPL作用L428細(xì)胞48小時后,caspase3、9原始

14、帶隨濃度的增加明顯下調(diào),而激活帶明顯上調(diào);PARP原始帶隨濃度的增加明顯下調(diào),而激活帶明顯上調(diào);Bcl-2表達(dá)水平隨藥物的濃度增加而顯著下調(diào),Bax表達(dá)水平則上調(diào).提示TPL可能通過線粒體途徑以及改變Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表達(dá)比例,促使細(xì)胞色素C等多種凋亡因子的釋放誘導(dǎo)霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡; 4.TPL聯(lián)合PS-341作用L428細(xì)胞24小時,caspase3、9原始帶在聯(lián)藥處理后明顯下調(diào),而激活帶明顯上調(diào);