活性氧介導(dǎo)的椪柑原生質(zhì)體再生能力差異的機(jī)理研究.pdf

1、原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交技術(shù)為柑橘遺傳育種工作開辟了一條新思路，它已成為柑橘砧木及接穗品種改良的重要手段。目前，柑橘原生質(zhì)體主要由愈傷組織和葉片分離而來，但只有來于前者的原生質(zhì)體能持續(xù)分裂并再生，而葉肉原生質(zhì)體目前還不能單獨(dú)用于柑橘遺傳改良。迄今，這兩種類型原生質(zhì)體再生能力差異的機(jī)制尚不清楚。已有研究表明，活性氧(ROS)引起的氧化脅迫可能是造成不可再生型原生質(zhì)體再生難的原因，然而另一方面ROS作為信號(hào)分子，對(duì)原生質(zhì)體再生具有重要的調(diào)控

2、作用，抑制其產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體不可分裂再生?；诖耍菊撐囊詶崭逃鷤M織和葉片為起始材料，采用熒光標(biāo)記法分析了ROS在椪柑原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)中的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)通過NADPH氧化酶特異性抑制劑DPI和過氧化物酶抑制劑NaN3處理探究了其ROS的來源;分析了NADPH氧化酶基因家族成員在椪柑原生質(zhì)體分離培養(yǎng)過程中的表達(dá)情況，克隆了一個(gè)特異表達(dá)的NADPH氧化酶基因（Crrboh10）;構(gòu)建了Crrboh10的過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

3、獲得了轉(zhuǎn)基因愈傷組織，并測(cè)定了椪柑轉(zhuǎn)基因愈傷組織和非轉(zhuǎn)基因愈傷組織的可溶性蛋白含量和H2O2含量。主要研究結(jié)果如下:
　　1.選取椪柑愈傷組織與葉肉原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)過程中5個(gè)時(shí)間點(diǎn):即酶解2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)，培養(yǎng)4天、8天的原生質(zhì)體，進(jìn)行ROS熒光探針染色并用共聚焦顯微鏡觀察檢測(cè)。結(jié)果表明，在愈傷組織原生質(zhì)體培養(yǎng)階段，細(xì)胞膜上出現(xiàn)明顯的ROS信號(hào)，而葉肉原生質(zhì)體中ROS信號(hào)無明顯差異;分離階段愈傷組織原生質(zhì)體其ROS水平顯著

4、低于葉肉原生質(zhì)體，但在培養(yǎng)階段顯著高于葉肉原生質(zhì)體。
　　2.選取椪柑愈傷組織原生質(zhì)體體分離與培養(yǎng)過程中4個(gè)時(shí)間點(diǎn):即酶解2小時(shí)、培養(yǎng)4天、8天、12天的原生質(zhì)體，進(jìn)行DPI和NaN3處理。結(jié)果表明，兩種抑制劑處理均降低了原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)過程中的ROS水平，表明椪柑愈傷組織原生質(zhì)體其活性氧產(chǎn)生源有NADPH氧化酶和過氧化物酶。
　　3.利用半定量RT-PCR方法分析了13個(gè)柑橘NADPH氧化酶基因在原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)過程中

5、的表達(dá)情況。結(jié)果表明，中共檢測(cè)到9個(gè)基因（Crrboh1、Crrboh2、Crrboh5-6、Crrboh8-9及Crrboh10-12）的表達(dá)，且變化趨勢(shì)有明顯差異;不表達(dá)的基因是Crrboh3、Crrboh4、Crrboh7、crrboh13。
　　4.克隆了椪柑Crrboh10基因，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)分析。該基因全長(zhǎng)2812 bp，開放閱讀框2748 bp，編碼915個(gè)氨基酸;該基因編碼的蛋白分子量為103.51 kD，理論等電

6、點(diǎn)為9.11。使用實(shí)時(shí)定量PCR分析Crrboh10基因在椪柑組織中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在根、莖、葉、愈傷組織中均有表達(dá)，表達(dá)量由高到低依次為愈傷組織、葉、根、莖。
　　5.將椪柑Crrboh10基因?qū)胫参镫p元表達(dá)載體pMD1301上，構(gòu)建了pMD1301-Rboh10超表達(dá)載體以及將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。以椪柑愈傷組織為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，采用GUS組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行鑒定，成功獲得