阿爾茨海默病過程中單核細胞和T淋巴細胞遷移入腦機制的探討.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種進行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，它的發(fā)病率約占65-69歲人群的0.6％，70-74歲人群的1.0％，在85歲以上人群中的比例占到了8.4％，從而成為日益突出的公共健康問題。AD的主要病理特征包括進行性記憶減退、認知功能障礙、以及人格改變，影響病人的日常生活。這些癥狀的出現(xiàn)是神經(jīng)元死亡的結(jié)果，尤其是邊緣系統(tǒng)和皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)，這些與記憶相關的部位。
　　AD病因

2、是復雜且多種多樣的，發(fā)病機制也有很多種解釋，目前研究的熱點主要集中在AD腦內(nèi)存在的免疫炎癥反應，以及其應用于臨床治療的前景;炎性介質(zhì)，氧化應激反應，后天獲得性免疫之間的相互作用。在AD腦內(nèi)的病理損傷部位存在著與外周免疫反應相同特征的炎性反應。在外周免疫系統(tǒng)，退化的組織和大量不可溶的非正常物質(zhì)的沉積都是免疫反應發(fā)生的誘因。同樣的，在AD腦內(nèi)，受損的神經(jīng)元，不可溶性Aβ(amyloidbeta)的沉積和神經(jīng)纏結(jié)等也都可以成為炎癥反應發(fā)生的誘

3、因。
　　目前有許多證據(jù)表明AD伴隨著全身性免疫反應，血液中免疫細胞的分布及反應性都會發(fā)生變化。神經(jīng)炎性反應會導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的蛋白質(zhì)，比如Aβ或者炎性介質(zhì)透過血腦屏障進入外周血。這將導致全身性免疫反應，骨髓源細胞及淋巴細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)積聚。因此，AD病人中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周免疫系統(tǒng)間的交通將影響免疫細胞在外周血和腦內(nèi)的分布以及免疫介質(zhì)的產(chǎn)生。
　　血液來源的免疫細胞在AD發(fā)病方面的作用過去常常被忽視，但如今已經(jīng)非常受到

4、重視。有研究證明APP23轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中有免疫細胞浸潤，其中27％-31％為T細胞，7％是單核細胞，更有研究表明在AD腦內(nèi)，許多細胞因子和炎性趨化因子水平明顯高于正常老年人群。這些證據(jù)強烈的提示免疫系統(tǒng)在AD病變的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。
　　AD腦內(nèi)存在的單核吞噬細胞可以被Aβ以及促炎性因子，炎性趨化因子直接活化，也可以與進入腦內(nèi)的T淋巴細胞發(fā)生“cross-talk”而活化，活化的單核吞噬細胞可以分泌細胞因子影

5、響神經(jīng)元功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應。因此，針對外周血免疫細胞跨血腦屏障遷移入腦機制的研究有重大科學意義。
　　方法:
　　1、AD病人外周血單核細胞高表達CSF2RB對其跨血腦屏障遷移的影響
　　(1)AD病人外周血單核細胞的分離:選取沈陽地區(qū)AD病30例，同年齡健康對照26例，用肝素抗凝處理過的試管，于清晨空腹采肘靜脈血，室溫放置，采血后3小時內(nèi)用分離人外周血單核細胞的Dynabeads(@)CD14磁珠試劑盒分離人

6、外周血單核細胞，用Trazol裂解后提取總RNA并委托公司進行基因芯片檢測。
　　(2)根據(jù)芯片檢測結(jié)果，篩選有表達差異的基因，并選取其中的CSF2RB基因進行研究。
　　(3)采用定量PCR方法驗證AD病人外周血單核細胞中CSF2RB基因表達的變化。
　　(4)利用本課題組制作的AD大鼠模型，術后3天和7天分別采集外周血并分離單核細胞，定量PCR方法驗證CSF2RB基因的表達是否與對照組存在差異。
　　(5)利

7、用慢病毒載體，構建特異性CSF2RB基因沉默的RNA干擾質(zhì)粒，制備得到高滴度的慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)染單核細胞株THP-1細胞，建立CSF2RB基因沉默的單克隆細胞系。
　　(6)利用CSF2RB基因沉默的THP-1細胞系進行細胞遷移實驗，分析CSF2RB對單核細胞遷移能力的影響。
　　2、探討AD病人腦內(nèi)高水平GM-CSF增加血腦屏障通透性的機制
　　(1)將培養(yǎng)的HBMECs在生長狀態(tài)良好時，接種到Transwell建立體

8、外血腦屏障模型，觀察經(jīng)過GM-CSF處理HBMECs后跨內(nèi)皮細胞電阻值(TransEndothelial Electrical Resistance, TEER)的變化。
　　(2)采用HRP flux分析GM-CSF處理HBMECs后，體外血腦屏障模型通透性的改變。
　　(3)細胞毒性實驗檢測GM-CSF對于HBMECs生長是否有影響。
　　(4) GM-CSF處理HBMECs后，分別使用Real-time PCR、

9、Western blot檢測粘附連接蛋白VE-cadherin和緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin、claudin-3、claudin-5的表達水平。
　　(5)擴增ZO-1啟動子區(qū)域(-2787～+1)，應用雙熒光素酶報告基因檢測GM-CSF對ZO-1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。
　　(6)Western Blot檢測occludin在NP-40可溶型和不可溶型間的轉(zhuǎn)化。
　　(7)免疫共沉淀檢測claudin-5泛素化

10、修飾水平。
　　3、探討AD疾病外周血T淋巴細胞入腦的機制
　　(1)構建Aβ1-42腦內(nèi)沉積動物模型，免疫熒光檢測腦微血管內(nèi)皮細胞MHC-I表達情況。
　　(2)使用Aβ、BV2培養(yǎng)上清液、Aβ刺激的BV2培養(yǎng)上清液作用HBMECs后，分別使用Real-time PCR、Westem blot檢測MHC-I表達水平。
　　(3)構建含有BV2小膠質(zhì)細胞的體外血腦屏障模型，模擬AD腦微環(huán)境對T淋巴細胞系進行遷移分

11、析和粘附分析，并使用MHC-I中和抗體進行抗體封閉實驗。
　　(4)使用siRNA干擾HBMECs MHC-I表達，進行T淋巴細胞遷移分析及粘附分析。
　　(5)使用TNF-α中和抗體處理經(jīng)Aβ刺激的BV2上清，作用HBMECs后，分別使用Real-time PCR、Western blot檢測MHC-I表達水平。
　　(6)在Aβ反應性的BV2介導的粘附和遷移實驗中，使用TNF-α中和抗體進行封閉實驗。
　　結(jié)

12、果：
　　1、AD病人外周血單核細胞高表達CSF2RB有助于其跨血腦屏障遷移
　　(1)與同齡對照者相比，AD病人CSF2RB基因表達上調(diào)。
　　(2)AD大鼠模型外周血單核細胞中CSF2RB表達上調(diào)。
　　(3)慢病毒介導的特異性CSF2RB基因沉默THP-1單克隆細胞株跨血腦屏障遷移的能力下降。
　　2、AD病人腦內(nèi)高水平GM-CSF改變緊密連接蛋白表達和分布，增加血腦屏障通透性
　　(1)GM-

13、CSF處理HBMECs后跨內(nèi)皮細胞電阻值降低。
　　(2)GM-CSF處理HBMECs后HRP通過率增高。
　　(3)GM-CSF抑制ZO-1啟動子活性，下調(diào)ZO-1蛋白表達。
　　(4)GM-CSF增加claudin-5泛素化修飾，促進其降解。
　　(5)GM-CSF促進occludin由NP-40不可溶型向可溶型轉(zhuǎn)化。
　　3、Aβ誘導腦微血管內(nèi)皮細胞高表達MHC-I，促進外周血T淋巴細胞遷移入腦

14、>　　(1)AD大鼠模型腦微血管內(nèi)皮細胞高表達MHC-I。
　　(2)Aβ刺激的BV2培養(yǎng)上清可上調(diào)HBMECs MHC-I表達水平。
　　(3)使用MHC-I中和抗體及siRNA干擾HBMECs MHC-I，能夠抑制T淋巴細胞MHC-I依賴性的遷移及粘附。
　　(4)Aβ可上調(diào)小膠質(zhì)細胞TNF-α表達，并引起HBMECs MHC-I表達增加。
　　(5)TNF-α中和抗體能夠抑制Aβ反應性小膠質(zhì)細胞介導的T淋巴