急性髓系白血病初診患者組織蛋白酶B、L及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)及意義.pdf

1、目的
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)CTSB、CTSL及VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)水平,分析三者在AML初診患者中及良性血液病患者中的表達(dá)變化及相關(guān)性。
　　 方法
　　 一、選取研究對(duì)象
　　 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液病治療中心2009年1月-2011年1月住院及門診的AML患者41例,其中M11例,M210例,M310例,M49例,M59例,M62例,非惡性血液病患者25例做為對(duì)

2、照組。所有病例經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)免疫分型及PCR融合基因檢測(cè)確診為AML(FAB)。
　　 二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
　　 收集患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞,提取總RNA,按試劑盒說(shuō)明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA,引物由Takara公司設(shè)計(jì)合成,采用SYBR Green I實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法,以β-actin為內(nèi)參照,進(jìn)行SYRB Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)CTSL、CTSB及VEGF的表達(dá)水

3、平。
　　 三、結(jié)果判斷
　　 將標(biāo)準(zhǔn)品cDNA10倍濃度梯度稀釋為5-6個(gè)濃度梯度,各取2μl作為模板進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng),由各擴(kuò)增曲線得到的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而得到樣本的拷貝數(shù)。以β-actin作為內(nèi)參照,CTSL、CTSB及VEGF作為目的基因,通過(guò)目的基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比值進(jìn)行樣本間相對(duì)定量的比較。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包中Mann-Whi

4、tney檢驗(yàn),相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、方法的可靠性和準(zhǔn)確性
　　 1、RNA的純度和質(zhì)量分析
　　 所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè),比值在1.8-2.0之間,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,條帶清晰可見,無(wú)明顯降解。
　　 2、擴(kuò)增的特異性及定量的準(zhǔn)確性
　　 標(biāo)準(zhǔn)品cDNA經(jīng)梯度稀釋后進(jìn)行PCR反應(yīng),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)

5、準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r2)均＞0.998,斜率在-3.3至-3.5之間,反映定量準(zhǔn)確,擴(kuò)增效率良好。擴(kuò)增后溶解曲線顯示銳利的單一鋒,無(wú)其他非特異性鋒,說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物均一,無(wú)非特異擴(kuò)增及引物二聚體。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增片段的均一性及長(zhǎng)度。
　　 二、CTSB、CTSL、VEGF的表達(dá)
　　 AML骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)中CTSB、CTSL mRNA的表達(dá)水平均明顯高于良性血液病患者(P＜0.05)。在AML中存在V

6、EGFmRNA的過(guò)度表達(dá),其表達(dá)水平明顯高于良性血液病組(P＜0.05)。在AML中,CTSB、CTSL與VEGF三者間的mRNA的表達(dá)相互間存在顯著正相關(guān)性。在初診的AML組中CTSB、CTSL及VEGF高表達(dá)與AML緩解率及髓外浸潤(rùn)相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 本研究表明VEGF、組織蛋白酶B、L在骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平與AML的發(fā)生發(fā)展及髓外浸潤(rùn)密切相關(guān),同時(shí)三者在此過(guò)程中還可能相互調(diào)控,共同完成侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程。隨著對(duì)組