活性維生素D3對糖尿病大鼠足細胞nephrin、podocin、WT1表達的影響.pdf

1、目的:本課題通過建立腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病SpragueDawley(SD)大鼠模型,應用活性維生素D3干預糖尿病大鼠,采用免疫組織化學、反轉錄PCR、光鏡等方法檢測SD大鼠腎組織,觀察活性維生素D3對其足細胞nephrin、podocin及WT1表達的影響,探討活性維生素D3是否可以改善糖尿病大鼠足細胞的濾過功能,從而減少蛋白尿、延緩腎臟病的進展,為糖尿病腎病的早期防治,提供實驗性理論依

2、據。
　　 Nephrin是足細胞上第一個被發(fā)現的跨膜蛋白,屬于免疫球蛋白超家族成員,特異表達在足細胞上,nephrin可誘導Akt途徑使數種靶蛋白磷酸化,保護及減少足細胞凋亡。Podocin通過CD-2AP連接于Nephrin形成復合體,呈發(fā)夾樣結構插入細胞膜內,其對Nephrin信號傳導有增強作用。他們表達異?？捎绊懩I小球濾過屏障通透性,導致蛋白尿的產生。故兩者對維持腎小球濾過屏障及足細胞功能和結構完整性發(fā)揮著極其重要的作用

3、。腎母細胞瘤抑制基因(WT1)對多種基因表達具有調節(jié)作用,是足細胞的特異標志之一,對維持足細胞的正常結構及功能有重要作用。
　　 方法:選擇清潔級SD(雄性)大鼠36只,體重200±20g,適應性喂養(yǎng)3天,隨機選取24只大鼠給予鏈脲佐菌素腹腔注射制備糖尿病模型,其余12只做正常對照組(NC組)。將造模成功的大鼠按隨機區(qū)組原則分為:糖尿病對照組(DN組)、活性維生素D3治療組(DT組),每組各12只。DT組在糖尿病模型建立之后予骨

4、化三醇0.03ug/(kg·d)灌胃;NC及DN組以等量的花生油灌胃。分別于模型成功后8、12周測定各組大鼠血鈣、血磷、血肌酐、血尿素氮以及24小時蛋白尿,并收集腎組織標本。用蘇木素伊紅(HE)在光鏡下觀察大鼠腎組織病理變化;采用免疫組織化學方法及RT-PCR檢測腎臟nephrin、podocin及WT1的表達。所得實驗數據用均數±標準差((x)±S)表示,各組間比較采用單因素方差分析(滿足正態(tài)性和方差齊性),兩組間的比較采用兩獨立樣本

5、t檢驗(不滿足正態(tài)性和方差齊性的數據資料采用非參數檢驗),實驗數據應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理,以P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:1一般情況DN組、DT組大鼠注射STZ后2～4天即出現多飲、多食、多尿,逐漸消瘦,活動減少,而NC組則無上述情況出現。
　　 2生化檢測結果各組大鼠24小時尿蛋白定量、血鈣、血磷、血肌酐及尿素氮的比較。8及12周末DN組大鼠尿蛋白定量、血肌酐與NC組比較,DN組升高明顯(P

6、＜0.05),DT組比DN組低(P＜0.05)。血鈣8周時DN較NC組降低,12周時降低更明顯;DT組在8周時與DN組比較差別不大,12周時血鈣水平較DN組高,但低于NC組。血磷水平同期各組間比較無差別(P＞0.05)。
　　 3組織化學變化蘇木精——伊紅染色(HE)結果光鏡HE染色顯示,整個實驗過程中NC組大鼠的腎臟組織均未見明顯病理學改變。與同期的NC組相比,12周末,DN組腎小球體積增大,腎小球系膜區(qū)增寬,系膜細胞增多。腎

7、間質、腎小管無明顯病理形態(tài)學改變。同期DT組腎小球病變不明顯。
　　 4免疫組織化學結果8周和12周末DN組、DT組與NC組比較大鼠腎組織中nephrin、podocin及WT1的表達減少,其中12周末降低更為顯著(P＜0.05);8周和12周末DT組較DN組各因子表達升高,但低于同期NC組(P＜0.05)。
　　 5ReverseTranscription-PCR(RT-PCR)結果與NC組大鼠相比,糖尿病大鼠腎組織中

8、nephrin、podocin及WT1表達降低,12周末變化更顯著(P＜0.05);8周和12周末DT組較DN組各因子表達升高,但低于同期NC組(P＜0.05)。
　　 結論:1糖尿病大鼠腎組織nephrin、podocin及WT1表達下降,與蛋白尿水平呈負相關,提示nephrin、podocin及WT1在糖尿病腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用。
　　 2活性維生素D3能夠明顯減輕糖尿病大鼠蛋白尿的產生及腎臟病理形態(tài)學