腫瘤細(xì)胞核移植的重新編程和核型變化研究.pdf

1、腫瘤目前是對人類生命最大的威脅，對腫瘤的發(fā)生機(jī)制做了大量的研究工作，但仍沒有公認(rèn)的能完全闡明的理論。腫瘤的細(xì)胞學(xué)特征包括以下五個(gè)方面：持續(xù)分裂增殖、去分化、逃避凋亡、轉(zhuǎn)移及血管生成。針對這幾個(gè)表型特征的抑制及逆轉(zhuǎn)治療都顯示了一定的應(yīng)用前景，但仍然沒有找到可以完全逆轉(zhuǎn)腫瘤的方法。對于腫瘤逆轉(zhuǎn)的可能性及可能的機(jī)制研究是腫瘤治療的一個(gè)新視點(diǎn)和鍥機(jī)。2004年RudolfJaenisch將小鼠畸胎瘤細(xì)胞作為供核細(xì)胞得到核移植囊胚，提取內(nèi)細(xì)胞團(tuán)注

2、入正常囊胚，最后得到嵌合體小鼠，顯示了通過核移植手段逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的可能性和可行性。 核移植(nucleartransfer或nucleartransplantation)是指用顯微操作的方法，將供核細(xì)胞的核移入去核的卵母細(xì)胞或早期合子內(nèi)，激活后核受體胞質(zhì)對供體核重新編程(reprogramming)，形成核移植重組胚。1997年二月Nature發(fā)表了Wilmut等的文章，即將一成年母羊乳腺細(xì)胞作為供核細(xì)胞構(gòu)建重組胚，再植入養(yǎng)母子

3、宮得到了Dolly羊。這是人類首次用體細(xì)胞核移植技術(shù)得到的哺乳類克隆動(dòng)物，遺傳性質(zhì)同供給體細(xì)胞的動(dòng)物完全一致。 發(fā)育成熟的體細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞核移植后發(fā)育的過程牽涉到對移入的細(xì)胞核的重新編程。移植的細(xì)胞核重新編程是否充分是決定核移植重組卵能否繼續(xù)發(fā)育及發(fā)育程度的重要因素。J.Gurdon曾將蝌蚪腸上皮的細(xì)胞核移植到去核的受精卵中，核移植重組胚不久后便終止發(fā)育，并且有相當(dāng)?shù)募?xì)胞核出現(xiàn)了非整倍的染色體組型。J.Gurdon又進(jìn)一步選取其

4、中有健康核型的細(xì)胞作為供核細(xì)胞，將其細(xì)胞核再次移植到去核卵母細(xì)胞中，這時(shí)7％的重組胚發(fā)育為成體。RudolfJaenisch將小鼠畸胎瘤細(xì)胞作為供核細(xì)胞進(jìn)行核移植也只能得到囊胚，不能進(jìn)一步發(fā)育，提取核移植囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)注入正常囊胚，才能得到嵌合體小鼠。這說明伴隨發(fā)育的進(jìn)行，細(xì)胞核的功能狀態(tài)發(fā)生了某種變化，只有能“恢復(fù)”到合適狀態(tài)的細(xì)胞核，才能實(shí)現(xiàn)核移植重組胚的正常發(fā)育。 本實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)有的核移植技術(shù)基礎(chǔ)上對核移植各操作過程及胚胎培養(yǎng)

5、條件進(jìn)行摸索與改進(jìn)，提高并穩(wěn)定核移植效率：1)用添加3％蔗糖的培養(yǎng)液短時(shí)間處理MⅡ期卵母細(xì)胞證實(shí)能實(shí)現(xiàn)小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞核的可視化，使得去核效率達(dá)100％，并且減少去核過程中的胞質(zhì)損失，利于重組胚進(jìn)一步發(fā)育。2)對比電脈沖、電脈沖+CHX、酒精+CHX、Sr2++CCB、Sr2++CHX+CCB五種重組胚激活方法的激活效果，發(fā)現(xiàn)各處理方式激活率和囊胚形成率有差異，Sr2++CHX+CCB激活效果最好。3)對比血清饑餓處理不同時(shí)間對供核細(xì)

6、胞B16細(xì)胞的損害和周期同步效果以及相應(yīng)的核移植效率，發(fā)現(xiàn)血清饑餓處理3-5天的B16細(xì)胞作為供核細(xì)胞效果最好。4)對比幾種不同參數(shù)的脈沖電波的電融合效果及相應(yīng)的重組胚發(fā)育效率，發(fā)現(xiàn)脈沖電壓及脈沖時(shí)程在一定范圍內(nèi)調(diào)整對融合效果沒有明顯影響，電壓過低過高或脈沖時(shí)程超出范圍對電融合不利。 將各個(gè)發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞核移植胚胎、腫瘤細(xì)胞核移植胚胎及孤雌激活胚胎這三組植入前胚胎的卵裂球進(jìn)行彗星試驗(yàn)檢測，經(jīng)軟件分析各組細(xì)胞的彗星試驗(yàn)圖像，對比

7、這三組胚胎細(xì)胞的核型，觀察重新編程過程對這三組胚胎細(xì)胞核的影響，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞核移植重組胚細(xì)胞相對于其它幾組細(xì)胞的核型有以下異常：1、腫瘤細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞M期卵裂球彗星試驗(yàn)圖像積分光密度分布較彌散，說明染色體異倍體比例很高。2、腫瘤細(xì)胞核移植胚2細(xì)胞期到8細(xì)胞期卵裂球行彗星試驗(yàn)可見彗尾，2細(xì)胞期尾DNA百分含量最大，到4、8細(xì)胞期逐漸減小，至桑椹胚期彗尾消失。其它幾組卵裂球彗星試驗(yàn)只有極少量可見彗星尾?？赡苁且?yàn)槟[瘤細(xì)胞核移植重新編程過