ERS和UPR信號(hào)通路在PBDE-47神經(jīng)毒性中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚是一類溴代阻燃劑型化合物,被廣泛作為一類重要的工業(yè)阻燃添加劑加入高分子合成材料中,作為防火材料廣泛地應(yīng)用于多種工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。由于沒有化學(xué)鍵的束縛,PBDEs易從產(chǎn)品中遷移出來進(jìn)入環(huán)境介質(zhì),導(dǎo)致環(huán)境污染。目前,世界上很多國家已經(jīng)從空氣、水、土壤、食物等多種環(huán)境介質(zhì)以及人群的血液、乳汁、脂肪等組織中發(fā)現(xiàn)了PBDEs的存在。由于PBDEs是一類持久性有機(jī)污染物,其在環(huán)境介質(zhì)中的含量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。
　　近年來,大量體內(nèi)外的

2、實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí),PBDEs可引起神經(jīng)毒性、生殖毒性、肝腎毒性、免疫毒性和致癌性等。由于PBDEs可通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)和乳汁排泄、加上嬰幼兒特有的手-口行為和頻繁的地面接觸及排泄PBDEs能力較成年人差等原因,致使嬰幼兒體內(nèi)PBDEs水平高于其它年齡段人群。嬰幼兒期是大腦快速發(fā)育時(shí)期,因而在PBDEs導(dǎo)致的多種毒性作用中,神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育毒性尤其受到人們的關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,在鼠大腦發(fā)育的關(guān)鍵期,暴露于于近似人體負(fù)荷量的PBDEs同系物,可

3、損害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦部運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知區(qū)域,表現(xiàn)為自發(fā)行為異常,感覺運(yùn)動(dòng)障礙,學(xué)習(xí)記憶能力下降,并伴隨染毒劑量增加或年齡增長而呈現(xiàn)惡化的趨勢(shì)。PBDEs如何引起大腦形態(tài)和功能的異常是當(dāng)前PBDEs神經(jīng)毒性作用研究的熱點(diǎn)之一,但PBDEs可通過哪些途徑影響自主行為和學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制目前仍不清楚。
　　PBDEs可引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧生成增多,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的始發(fā)因素,繼而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。有關(guān)P

4、BDEs實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,PBDEs可以引起神經(jīng)細(xì)胞由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡。神經(jīng)細(xì)胞異常過度的凋亡,必將引起神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的改變,引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。因此,細(xì)胞凋亡是PBDEs引起神經(jīng)毒性作用的關(guān)鍵因素之一。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是細(xì)胞凋亡三條經(jīng)典途徑之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)的正確折疊、組裝和運(yùn)輸?shù)膱鏊．?dāng)細(xì)胞受到體內(nèi)外不同強(qiáng)度刺激,如氧化應(yīng)激后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將產(chǎn)生未折疊蛋白/錯(cuò)誤折疊蛋白積聚,誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活

5、未折疊蛋白反應(yīng)的信號(hào)通路。持續(xù)或過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的紊亂,從而通過UPR信號(hào)通路活化相關(guān)分子而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　目前尚未見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR信號(hào)通路參與PBDEs致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的文獻(xiàn)報(bào)道。但新近研究發(fā)現(xiàn),PBDEs染毒大鼠海馬神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)病理性改變;PBDEs的代謝產(chǎn)物可使染毒細(xì)胞UPR信號(hào)通路相關(guān)基因如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、生長抑制和DNA損傷誘導(dǎo)家族基因153、GADD34及X盒結(jié)合蛋白1的表達(dá)發(fā)生改變

6、。根據(jù)目前相關(guān)研究結(jié)果所提供的初步線索,推測(cè)PBDEs可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR信號(hào)通路導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而引起神經(jīng)毒性。
　　基于上述理由,本課題利用在環(huán)境樣本和人體組織中含量最高、對(duì)生物和人體毒性作用最強(qiáng)的PBDEs同系物之一的2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(PBDE-47)作為目標(biāo)受試物,將體外培養(yǎng)的具有神經(jīng)細(xì)胞特性的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為受試細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。采用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、western

7、 blot和Hoechst33258細(xì)胞核染色等技術(shù)和方法,檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞ROS產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)細(xì)胞GRP78、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜感應(yīng)蛋白IRE1、XBP1、c-jun N末端激酶和CHOP等基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá),并通過小分子干擾RNA沉默IRE1后檢測(cè)細(xì)胞凋亡、UPR通路相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)的變化,探討 ERS與UPR細(xì)胞凋亡通路是否參與了PBDE-47致神經(jīng)細(xì)胞的毒性效應(yīng),明確IRE1通路在PBDE-47產(chǎn)生的神經(jīng)毒性中的作用

8、。以期在PBDE-47致神經(jīng)毒作用的分子機(jī)制研究方面獲得新的進(jìn)展,為PBDEs對(duì)機(jī)體危害作用的預(yù)防控制提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù),具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　第一部分 PBDE-47對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷并誘導(dǎo)UPR及激活I(lǐng)RE1信號(hào)通路
　　目的:明確PBDE-47是否通過誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生ERS和UPR而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用,為研究PBDE-47的神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供線索。
　　方法:SH-SY5Y細(xì)

9、胞暴露于不同濃度的PBDE-47,在不同時(shí)間點(diǎn)(3,6,12,24h),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其ROS產(chǎn)生水平;應(yīng)用real time RT-PCR技術(shù)和western blot技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GRP78、IRE1、CHOP、JNK、磷酸化JNK(phosphor-JNK,p-JNK)、Bcl-2以及Bax等UPR中IRE1通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比,一定劑量的PBDE-47在3-24h內(nèi)使SH-

10、SY5Y細(xì)胞ROS產(chǎn)生明顯增加(P<0.05)并具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系、GRP78和IRE1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系;用10μmol/L的PBDE-47處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后IRE1和CHOP的蛋白表達(dá)水平均明顯高于0,3,6和12h的表達(dá)水平(P<0.05);不同濃度的PBDE-47處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后,IRE1、CHOP和p-JNK蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)

11、,并具有濃度依賴性關(guān)系,Bcl-2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降(P<0.05),Bax/Bcl-2比值較對(duì)照組顯著增加(p<0.01)。
　　結(jié)論:PBDE-47可能通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生而引起細(xì)胞氧化應(yīng)激,并導(dǎo)致ERS發(fā)生和激活UPR,通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的IRE1通路參與了PBDE-47所致的神經(jīng)毒性作用。
　　第二部分 IRE1信號(hào)通路在PBDE-47致SH-S

12、Y5Y細(xì)胞毒性中的作用及其機(jī)制研究
　　目的:由于IRE1是UPR中對(duì)細(xì)胞存活與死亡起決定意義的跨膜感應(yīng)蛋白,IRE1具有重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控作用,因此本研究旨在探討IRE1細(xì)胞凋亡通路在PBDE-47致SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性中的作用。
　　方法:應(yīng)用siRNA技術(shù)將SH-SY5Y細(xì)胞IRE1基因沉默后再暴露于10μmol/L PBDE-4724h,利用光鏡和倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)以及經(jīng)Hoechst核染色的細(xì)胞核形態(tài)

13、;利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡,使用real time RT-PCR技術(shù)和western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GRP78、IRE1、非剪切形式XBP1-XBP1u、剪切形式XBP1-XBP1s、CHOP、JNK、p-JNK、Bcl-2以及Bax等UPR中IRE1通路凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:PBDE-47引起SH-SY5Y細(xì)胞體積收縮、呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)變化,活細(xì)胞數(shù)量減少;核染色質(zhì)呈現(xiàn)濃積、片斷化、核破裂和細(xì)

14、胞空泡樣等改變,并可見凋亡小體。沉默 IRE1基因后,PBDE-47引起細(xì)胞的凋亡性形態(tài)改變明顯增加(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PBDE-47可顯著增加細(xì)胞凋亡率(P<0.05),沉默IRE1基因后PBDE-47引起的細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比,PBDE-47顯著升高 XBP1u、XBP1s、CHOP、JNK和Bax的mRNA表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01),明顯降低Bcl-2的mRNA表達(dá)水

15、平(P<0.05);與陰性對(duì)照+PBDE-47組相比,沉默IRE1基因后,用PBDE-47處理的細(xì)胞XBP1s、CHOP、JNK和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05或 P<0.01),但Bax mRNA表達(dá)水平卻顯著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2比值明顯增加(P<0.05)。與陰性對(duì)照+PBDE-47組相比,沉默IRE1基因后,用PBDE-47處理的細(xì)胞CHOP、JNK和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.

16、05),但Bax蛋白水平顯著上升(P<0.05),Bax/Bcl-2比值均明顯增加(P<0.01)。
　　結(jié)論:IRE1通過上調(diào)XBP1s、JNK和CHOP的表達(dá)激活相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路,從而對(duì)細(xì)胞具有抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用;Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)和Bax表達(dá)水平上升,Bax/Bcl-2比值顯著升高是沉默IRE1后PBDE-47引起SH-SY5Y細(xì)胞凋亡增加的重要原因。在24h,IRE1對(duì)PBDE-47引起的SH-SY