[Ca2+]i在PBDE-47致細(xì)胞凋亡過程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenylethers,PBDEs)是一種具有價(jià)格低廉、添加量少、阻燃效率高且對材料性能影響較小等優(yōu)點(diǎn)的溴代阻燃劑(brominated flameretardants,BFRs),已廣泛應(yīng)用于電子電氣設(shè)備、電纜、建筑材料、家具和紡織品等商業(yè)產(chǎn)品中。PBDEs因不易與聚合物共價(jià)結(jié)合而易釋放到環(huán)境中,且難以降解,是一類新的環(huán)境持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollu

2、tants,POPs),已在多種環(huán)境介質(zhì)、動物以及人類組織中檢測到,且含量呈逐年增加的趨勢。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn),PBDEs對人體健康可造成多種危害,包括肝臟毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性及神經(jīng)發(fā)育毒性、內(nèi)分泌干擾作用及致癌作用等。多項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明,暴露PBDEs能影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,主要表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降,行為能力紊亂和學(xué)習(xí)記憶能力缺損,且隨年齡增長而加重。嬰幼兒容易通過母乳和室內(nèi)塵埃暴露PBDEs,其體內(nèi)PBDEs含

3、量在不同年齡段人群中最高,因此PBDEs的神經(jīng)發(fā)育毒性受到廣泛關(guān)注。然而,目前有關(guān)PBDEs神經(jīng)發(fā)育毒性的毒作用機(jī)制研究仍較少,因此針對PBDEs神經(jīng)發(fā)育毒性的毒作用機(jī)制展開研究意義重大,有利于深入認(rèn)識其神經(jīng)毒作用特點(diǎn),為預(yù)防控制PBDEs神經(jīng)發(fā)育毒性提供理論依據(jù)。
　　細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD),對維持機(jī)體內(nèi)細(xì)胞動態(tài)平衡和胚胎發(fā)育非常重要。細(xì)胞凋亡異常如不

4、凋亡或過度凋亡均會造成諸多疾病的發(fā)生,且多與外源化合物的刺激作用有關(guān)。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使對維持細(xì)胞正常生理功能具有重要意義,然而細(xì)胞在外界刺激下,細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的改變則會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular free calciumionconcentration,[Ca2+]i)升高是細(xì)胞凋亡過程中普遍存在的事件。線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)下降

5、與細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān),是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性事件。近年來已有研究發(fā)現(xiàn),暴露PBDE-99和PBDE-153后大鼠海馬中的膽堿能受體發(fā)生改變,而且PBDE-99還能誘導(dǎo)人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡,在用PBDE-99染毒的人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和PC12細(xì)胞中均觀察到PKCs活化和[Ca2+]i升高。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)PBDE-47能誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞)及原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元DNA損傷和凋亡,并在凋

6、亡過程中觀察到[Ca2+]i升高,由此推測:PBDEs神經(jīng)發(fā)育毒性的毒作用機(jī)制可能是PBDEs破壞細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　PBDE-47是人體和環(huán)境中含量最高的PBDEs同系物之一,SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)和生理性質(zhì)與正常神經(jīng)細(xì)胞類似,是研究神經(jīng)細(xì)胞毒性的常用細(xì)胞模型。因此,本實(shí)驗(yàn)擬用不同濃度PBDE-47對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行染毒,研究PBDE-47致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程中[Ca2+]i變化及其機(jī)制,為進(jìn)

7、一步開展PBDE-47神經(jīng)毒作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
　　本研究主要由以下二部分組成。
　　第一部分：PBDE-47對SH-SY5Y細(xì)胞[Ca2+]i和ΔΨm的影響
　　目的:研究PBDE-47對體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞[Ca2+]i和ΔΨm的影響。
　　方法:將體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞暴露于不同濃度PBDE-47(1、5、10μmol/L),以DMSO作為溶劑對照,分別利用Ca2+熒光探針1-[2-A

8、mino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraaceticacid,pentaacetoxymethylester(Fluo-3/AM)和線粒體膜電位(ΔΨm)檢測熒光探針5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimid

9、azolcarbocyanineiodide(JC-1)孵育染色細(xì)胞,通過激光掃描共焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)動態(tài)觀測染毒1h內(nèi)[Ca2+]i的動態(tài)變化,并用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測染毒24h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的[Ca2+]i水平和染毒24h后ΔΨm的變化情況以及細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:10μmol/LPBDE-47染毒細(xì)胞24h后,細(xì)胞的早期凋亡率和

10、總凋亡率均明顯高于對照組、1μmol/LPBDE-47染毒組和5μmol/LPBDE-47染毒組。各染毒組的[Ca2+]i在染毒1h內(nèi)均明顯升高(P<0.05),且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對照組相比,10μmol/LPBDE-47染毒組在3h、6h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)的[Ca2+]i均出現(xiàn)不同程度的升高(P<0.05);5μmol/LPBDE-47染毒組在3h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)的[Ca2+]i也明顯升高(P<0.05),而1μmol

11、/LPBDE-47染毒組僅在6h時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)[Ca2+]i的明顯升高(P<0.05)。染毒24h后5μmol/L和10μmol/LPBDE-47染毒組與對照組相比ΔΨm顯著下降(P<0.05),但1μmol/LPBDE-47染毒組的ΔΨm變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:PBDE-47導(dǎo)致[Ca2+]i早期且持續(xù)升高和ΔΨm下降,細(xì)胞內(nèi)鈣信號紊亂可能是PBDE-47誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的早期事件,且與ΔΨm變化有關(guān)。

12、>　　第二部分：PBDE-47致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程中[Ca2+]i變化機(jī)制及其與ΔΨm之間的關(guān)系
　　目的:探索PBDE-47導(dǎo)致[Ca2+]i升高的原因及其與ΔΨm間的關(guān)系
　　方法:對體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞分別用細(xì)胞外鈣離子螯合劑EGTA和細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA/AM將細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的Ca2+螯合(其中BAPTA/AM在染毒前預(yù)處理細(xì)胞30min;而EGTA在染毒時(shí)加入DMEM培養(yǎng)基中,作用時(shí)間與染毒

13、時(shí)間一致),再用10μmol/LPBDE-47染毒24h,然后通過FCM檢測[Ca2+]i和ΔΨm的變化情況。
　　結(jié)果:對照組與EGTA組和BAPTA/AM組之間[Ca2+]i和ΔΨm差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明EGTA和BAPET/AM對SH-SY5Y細(xì)胞[Ca2+]i和ΔΨm沒有影響,不具有明顯毒性作用。與對照組相比,10μmol/LPBDE-47組和10μmol/LPBDE-47+BAPTA/AM組[Ca2+]