應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)研究HBV慢性肝病中醫(yī)證型與細(xì)胞因子的相關(guān)性.pdf

1、目的：細(xì)胞因子是指由細(xì)胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質(zhì)的統(tǒng)稱，研究發(fā)現(xiàn)HBV慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展及其演變與細(xì)胞因子密切相關(guān)。蛋白芯片是繼基因芯片后發(fā)展起來的一種新的生物檢測(cè)技術(shù)，它的出現(xiàn)對(duì)于生物學(xué)、臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)和藥理學(xué)等多學(xué)科的進(jìn)步具有極大的推動(dòng)作用。目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞因子通常采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，但ELISA存在著靈敏度較低、重復(fù)性較差、分析范圍較窄等問題，而具有快速、并行、自動(dòng)化和高通量的特點(diǎn)蛋白芯片

2、則可以彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)。因此參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，選取IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、sICAM-1、TGF-β<,1>、TIMP-1等7種細(xì)胞因子做為研究靶點(diǎn)，自行構(gòu)建蛋白芯片，分析蛋白芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA敏感性和特異性的差別；并借助蛋白芯片技術(shù)研究這7種細(xì)胞因子在不同類型的HBV慢性肝病中變化規(guī)律，尋求能夠準(zhǔn)確反應(yīng)肝臟炎癥及纖維化程度的新指標(biāo)；探討慢性乙型病毒性肝炎、乙肝肝硬化患者不同中醫(yī)證型與7種細(xì)胞因子的相關(guān)性，尋求中西

3、醫(yī)的交融之處，豐富中醫(yī)“證”的微觀指標(biāo)學(xué)說，為慢性肝病中醫(yī)“證”的客觀化和規(guī)范化研究奠定基礎(chǔ)。 方法：將洗凈的載玻片放入以1:50丙酮稀釋的APES中，停留20～30s，取出后再用純丙酮溶液沖洗。將7種血清標(biāo)志物的單克隆抗體用PBS(0.01mol/L，pH7.0)稀釋為500mg/L，用Cartisian 5500機(jī)器人點(diǎn)樣于APES玻片上，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)重復(fù)。將芯片放于37℃孵育4h，用PBST洗滌3×15s，用封閉液于37

4、℃封閉2h，用PBST洗滌3次×15s，晾干備用。以500mg/L生物素標(biāo)記的BSA為陽(yáng)性對(duì)照，用無生物素標(biāo)記的500mg/L BSA為陰性對(duì)照。從-80℃冰箱中取出血清樣品，置冰盒上溶解后，以5000g，4℃離,~'5min。取10μl血清，用樣本稀釋液稀釋10倍，400～600r/min冰浴震蕩30min。運(yùn)用點(diǎn)樣儀向每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl處理好的樣品，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，然后加入生物素標(biāo)記的7種細(xì)胞因子的單克隆抗

5、體20μl(濃度為1μg/ml)，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，再加入Cy3標(biāo)記的親和素，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，晾干。將蛋白芯片用ScanArray4000激光共聚焦掃描儀掃描成像，掃描后的圖象用Imagene軟件分析熒光強(qiáng)度，對(duì)所有原始數(shù)據(jù)根據(jù)單個(gè)膜陽(yáng)性與陰性對(duì)照值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理及減除背景處理，取4個(gè)反應(yīng)孔熒光強(qiáng)度的平均值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算與分析結(jié)果。將蛋白芯片結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較后，選擇慢性乙型病毒性肝炎

6、患者90例，其中輕、中、重度各30例，參照1991年天津會(huì)議所制定的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)(試行)》進(jìn)行辨證分型，濕熱中阻型20例，肝郁脾虛型26例，瘀血阻絡(luò)型21例，肝腎陰虛型14例，脾腎陽(yáng)虛型9例；乙肝肝硬化患者共90例，A、B、C級(jí)各30例，中醫(yī)辨證參考1993年洛陽(yáng)會(huì)議所制定的《肝硬化臨床診斷、中醫(yī)辨證和療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行方案)》，其中肝氣郁結(jié)22例，脾虛濕盛18例，濕熱內(nèi)蘊(yùn)12例，肝腎陰虛7例，脾腎陽(yáng)虛11例，血瘀證20例；

7、慢性重型乙型病毒性肝炎30例。借助蛋白芯片技術(shù)明確7種細(xì)胞因子在不同類型HBV慢性肝病的變化規(guī)律，并探討其與中醫(yī)證型的相關(guān)性。 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建血清細(xì)胞因子蛋白芯片，并建立良好的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)中比較了蛋白芯片與ELISA對(duì)IL-2、IL-4、TNF-α3種因子的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對(duì)34例臨床標(biāo)本的檢測(cè)中，蛋白芯片及ELISA法均未能檢測(cè)到IL-2、IL-4，而蛋白芯片卻檢測(cè)到8例慢性乙肝重度患者血清中的TNF-α，ELIS

8、A法僅檢測(cè)出其中的5例。(2)慢性肝病組7種細(xì)胞因子與正常對(duì)照組均有顯著差異(P<0.05)，IL-2、IFN-γ等Th1類細(xì)胞因子在慢乙肝輕度中水平基本正常，慢重肝患者濃度最低(P<0.01)；慢重肝Th2類細(xì)胞因子IL-4高達(dá)258.56±36.72 pg/ml，與其它組有顯著差異(P<0.01)，具體變化規(guī)律為輕度

9、1>為輕度<中度<重度 sICAM-1及TIMP-1均較

10、正常組顯著升高(P<0.01)，濕熱內(nèi)阻證TNF-α濃度為433.58±24.44 pg/ml，上升幅度最大，TGF-β<,1>、sICAM-1及TIMP-1則以瘀血內(nèi)阻證升高最明顯；肝郁脾虛及濕熱內(nèi)阻證患者血清IFN-γ與正常組無差異，而另外3種證型IFN-γ水平均顯著低于正常組(P<0.01)。(4)肝硬化患者除濕熱內(nèi)阻型血清IFN-γ(62.68±8.56 pg/ml)與正常對(duì)照組無顯著差異外，其余各證型患者血清細(xì)胞因子均與正常組

11、有顯著差異(P<0.01)；脾虛濕盛、脾腎陽(yáng)虛、血瘀證3型IL-2水平顯著低于肝氣郁結(jié)(P<0.01)，而IL-4、TNF-α水平較肝氣郁結(jié)顯著升高(P<0.01)；TGF-β<,1>、sICAM-1在濕熱內(nèi)阻型中水平最低(P<0.05～0.01)；TIMP-1則在肝氣郁結(jié)中濃度167.88±14.21 ng/ml，與其它證型有顯著差異(P<0.05～0.01)；濕熱內(nèi)阻證IFN-γ濃度為62.68±8.56 pg/ml，與肝氣郁結(jié)證(

12、58.37±9.75 pg/ml)無顯著差異，其余證型均低于肝氣郁結(jié)證(P<0.01)。 結(jié)論：蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)血清細(xì)胞因子較傳統(tǒng)的EL,ISA具有更高的敏感性和可重復(fù)性；HBV慢性肝病患者血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、sICAM-1、TGF-β<,1>、TIMP-1的水平在一定程度上可反應(yīng)肝臟炎癥及纖維化程度；慢性乙型病毒性肝炎、乙肝肝硬化患者不同中醫(yī)證型與血清細(xì)胞因子有一定相關(guān)性，可以將細(xì)胞因子納入