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1、為探討影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素,建立和優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系,本研究以4種基因型小麥的幼胚愈傷、12種基因型小麥的成熟胚愈傷為受體通過組織培養(yǎng)的途徑,以及以12種基因型小麥的種子直接切胚、莖尖生長點轉(zhuǎn)化非組織培養(yǎng)的途徑,用攜帶潮霉素篩選基因和GUS標記基因的農(nóng)桿菌LBA4404、C58C1對小麥進行轉(zhuǎn)化,建立并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化體系,同時對兩種途徑轉(zhuǎn)化法做了比較,獲得了如下結(jié)果:1、組培轉(zhuǎn)化途徑中,以幼胚愈傷為受體,在MS、N6、SD2三種基
2、本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,調(diào)整激素的濃度和配比,篩選出適合幼胚愈傷高效轉(zhuǎn)化的SK培養(yǎng)基:SD2+KT1mg/L+6BA0.5mg/L+ZT3mg/L;同時得出小麥的不同基因型對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化有影響;幼胚愈傷的生理狀態(tài)是愈傷再分化的關(guān)鍵因素,只有結(jié)構(gòu)緊密外觀淡黃色的胚性愈傷才有再分化的潛力。 2、組培轉(zhuǎn)化途徑中,以成熟胚愈傷為受體,改進成熟胚的誘導(dǎo)方式,用以往的整體成熟胚誘導(dǎo)為將成熟胚刮碎誘導(dǎo),這種改進完全避免了成熟胚不長愈傷而直接出芽現(xiàn)
3、象的發(fā)生,將成熟胚的誘導(dǎo)愈傷率提高了40%-50%;建立了成熟胚為受體的轉(zhuǎn)化體系:SK中2,4-D的濃度為4mg/L,農(nóng)桿菌活化、侵染、共培養(yǎng)三個環(huán)節(jié)均添加200μM的乙酰丁香酮;同時得出小麥的基因型與出愈率無關(guān),與胚性愈傷率、轉(zhuǎn)化率有關(guān),本實驗中的山農(nóng)15、山農(nóng)11、揚麥158、煙農(nóng)15和Bobwhite基因型小麥適宜做以成熟胚愈傷為受體的轉(zhuǎn)化材料;出愈率、胚性愈傷率、轉(zhuǎn)化率三者之間不呈正相關(guān)。 3、非組培轉(zhuǎn)化途徑中,以12種
4、基因型小麥種子直接切胚進行轉(zhuǎn)化,對小麥種子的處理及小麥種子與農(nóng)桿菌的相互作用進行了研究,建立了轉(zhuǎn)化體系:小麥種子37℃水浴3-4小時切胚,與含200μM乙酰丁香酮、菌液濃度OD650=0.6的農(nóng)桿菌在28℃黑暗條件下,振蕩培養(yǎng)14-16小時;同時得出轉(zhuǎn)化率與小麥基因型無關(guān)。 4、非組培轉(zhuǎn)化途徑中,以12種基因型小麥的莖尖生長點為受體進行轉(zhuǎn)化,建立了轉(zhuǎn)化體系:小麥幼芽長到3-4cm時剝離莖尖生長點,用含200μM乙酰丁香酮、菌液濃
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