小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)不同遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及比較研究.pdf

1、為探討影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素，建立和優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系，本研究以4種基因型小麥的幼胚愈傷、12種基因型小麥的成熟胚愈傷為受體通過(guò)組織培養(yǎng)的途徑，以及以12種基因型小麥的種子直接切胚、莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化非組織培養(yǎng)的途徑，用攜帶潮霉素篩選基因和GUS標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌LBA4404、C58C1對(duì)小麥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，建立并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)對(duì)兩種途徑轉(zhuǎn)化法做了比較，獲得了如下結(jié)果：1、組培轉(zhuǎn)化途徑中，以幼胚愈傷為受體，在MS、N6、SD2三種基

2、本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，調(diào)整激素的濃度和配比，篩選出適合幼胚愈傷高效轉(zhuǎn)化的SK培養(yǎng)基：SD2+KT1mg/L+6BA0.5mg/L+ZT3mg/L；同時(shí)得出小麥的不同基因型對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化有影響；幼胚愈傷的生理狀態(tài)是愈傷再分化的關(guān)鍵因素，只有結(jié)構(gòu)緊密外觀淡黃色的胚性愈傷才有再分化的潛力。 2、組培轉(zhuǎn)化途徑中，以成熟胚愈傷為受體，改進(jìn)成熟胚的誘導(dǎo)方式，用以往的整體成熟胚誘導(dǎo)為將成熟胚刮碎誘導(dǎo)，這種改進(jìn)完全避免了成熟胚不長(zhǎng)愈傷而直接出芽現(xiàn)

3、象的發(fā)生，將成熟胚的誘導(dǎo)愈傷率提高了40％-50％；建立了成熟胚為受體的轉(zhuǎn)化體系：SK中2，4-D的濃度為4mg/L，農(nóng)桿菌活化、侵染、共培養(yǎng)三個(gè)環(huán)節(jié)均添加200μM的乙酰丁香酮；同時(shí)得出小麥的基因型與出愈率無(wú)關(guān)，與胚性愈傷率、轉(zhuǎn)化率有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中的山農(nóng)15、山農(nóng)11、揚(yáng)麥158、煙農(nóng)15和Bobwhite基因型小麥適宜做以成熟胚愈傷為受體的轉(zhuǎn)化材料；出愈率、胚性愈傷率、轉(zhuǎn)化率三者之間不呈正相關(guān)。 3、非組培轉(zhuǎn)化途徑中，以12種

4、基因型小麥種子直接切胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，對(duì)小麥種子的處理及小麥種子與農(nóng)桿菌的相互作用進(jìn)行了研究，建立了轉(zhuǎn)化體系：小麥種子37℃水浴3-4小時(shí)切胚，與含200μM乙酰丁香酮、菌液濃度OD650=0.6的農(nóng)桿菌在28℃黑暗條件下，振蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)；同時(shí)得出轉(zhuǎn)化率與小麥基因型無(wú)關(guān)。 4、非組培轉(zhuǎn)化途徑中，以12種基因型小麥的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，建立了轉(zhuǎn)化體系：小麥幼芽長(zhǎng)到3-4cm時(shí)剝離莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，用含200μM乙酰丁香酮、菌液濃