PEG-b-PLA聚合物膠束的細(xì)胞攝取機(jī)理研究.pdf

1、納米技術(shù)的進(jìn)步使得靶向藥物傳遞以及提高藥物的穩(wěn)定性、生物利用度和藥物在特定組織中的蓄積成為可能,納米藥物載體作為核苷酸類、蛋白質(zhì)類等生物大分子藥物及小分子化學(xué)藥物的載體已顯示出良好的發(fā)展前景。聚合物膠束作為一種納米載藥系統(tǒng),由于載藥范圍廣、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、粒徑較小及在體內(nèi)可以長(zhǎng)循環(huán)等特性受到人們的廣泛關(guān)注,用聚合物膠束包載藥物以減少藥物毒性、提高生物利用度等成為近年來研究的熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室前期工作用PEG-b-PLA聚合物膠束包載紫杉醇,發(fā)現(xiàn)其有

2、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的效果,研究其細(xì)胞內(nèi)吞途徑發(fā)現(xiàn)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是一個(gè)濃度、時(shí)間、能量依賴性的過程,進(jìn)一步采用化學(xué)抑制劑抑制一些細(xì)胞內(nèi)吞途徑的關(guān)鍵分子,發(fā)現(xiàn)其可能通過 lipid raft/caveolae途徑進(jìn)入細(xì)胞,但其具體的機(jī)理還不是很清楚,且采用的內(nèi)吞途徑抑制劑可能還存在不特異的問題。本文研究的目的是進(jìn)一步確定PEG-b-PLA聚合物膠束進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的途徑及在細(xì)胞內(nèi)的定位,為制備更有效的聚合物膠束納米載藥系統(tǒng)提供理論依據(jù)。本文在實(shí)

3、驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上主要開展了以下工作:
　　(1)以熒光染料尼羅紅作為模型藥物,采用薄膜分散法制備載尼羅紅的PEG-b-PLA聚合物膠束。激光粒度儀檢測(cè)其平均粒徑為50.90nm,基本上不帶電荷。透射電子顯微鏡觀察其形貌,顯示其為具有核-殼結(jié)構(gòu)的球形。
　　(2)用影響內(nèi)吞途徑關(guān)鍵分子dynamin的特異化學(xué)抑制劑dynasore處理A2780細(xì)胞后,采用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行定性和定量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)dynasore

4、能降低細(xì)胞內(nèi)尼羅紅的熒光強(qiáng)度,提示 dynamin可能參與 PEG-b-PLA聚合物膠束的內(nèi)吞途徑。為進(jìn)一步證明dynamin是否參與其內(nèi)吞途徑,采用電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染 EGFP、dynamin野生型質(zhì)粒和dynamin顯性負(fù)突變體 K44A至A2780細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入dynamin野生型質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)尼羅紅的熒光強(qiáng)度增加,而轉(zhuǎn)入dynamin顯性負(fù)突變體的細(xì)胞內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度降低,判定聚合物膠束進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是dynamin依賴性的。

5、>　　(3)采用激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀研究載尼羅紅的聚合物膠束在HepG2、Hela、C6細(xì)胞的內(nèi)吞情況,發(fā)現(xiàn)C6細(xì)胞內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度最強(qiáng),進(jìn)一步采用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C6細(xì)胞內(nèi)caveolin-1的表達(dá)最高,其他兩種細(xì)胞相對(duì)較少,提示caveolin-1可能參與PEG-b-PLA聚合物膠束的內(nèi)吞途徑。將HepG2和C6細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EGFP、caveolin-1野生型和caveolin-1顯性負(fù)突變體caveolin-1 Y14

6、F質(zhì)粒后,發(fā)現(xiàn)HepG2在轉(zhuǎn)染caveolin-1野生型質(zhì)粒后細(xì)胞內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度顯著增加,而C6細(xì)胞轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變體caveolin-1 Y14F后胞內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度顯著降低,提示 PEG-b-PLA聚合物膠束進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的途徑是 caveolin-1依賴性的。
　　(4)為研究clathrin途徑是否也參與PEG-b-PLA聚合物膠束的內(nèi)吞,我們將clathrin野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A2780細(xì)胞內(nèi),分別采用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)