眼表重建手術(shù)后早期供體干細胞的存活狀態(tài)及其影響因素研究.pdf

1、目的:
　　 體外培養(yǎng)的異體角膜緣上皮細胞移植術(shù)是治療角膜緣干細胞缺乏的有效方案，在臨床中我們觀察到術(shù)后有些患者會發(fā)生再次角膜新生血管化和角膜上皮反復(fù)缺損，考慮其原因可能為手術(shù)后供體細胞不能很好的存活并發(fā)揮功能。因此，本研究的目的是通過動物模型模擬該手術(shù)及術(shù)后的臨床過程，探討手術(shù)后供體細胞的存活狀態(tài)和其可能的影響因素，并進一步探討手術(shù)后可維持眼表穩(wěn)定的可行措施。
　　 方法:
　　 1、動物模型的建立和評價

2、>　　 采用4周齡雌性新西蘭大白兔45只，建立堿燒傷致兔眼角膜緣干細胞缺乏的動物模型。將實驗兔隨機分為2組:中度組和重度組，每組22只，每只兔均選右眼建模、手術(shù)。用內(nèi)徑12mm，外徑18mm的環(huán)形濾紙片浸透1mol/L NaOH，覆蓋于實驗兔角膜緣處，重度組接觸1 min，中度組接觸30s。然后用0.9％氯化鈉注射液沖洗角膜表面和結(jié)膜囊5分鐘。燒傷后每天觀察兔角膜變化，并于堿燒傷后穩(wěn)定期對角膜新生血管程度和炎癥程度進行評分。用HE染色

3、方法觀察比較正常兔角膜和堿燒傷后穩(wěn)定期兔角膜的組織病理學(xué)差異;用免疫組織化學(xué)方法檢測正常組和堿燒傷后穩(wěn)定期時兔角膜中p63、CD68的表達情況;用Real time-PCR方法檢測正常組和堿燒傷后穩(wěn)定期時兔角膜中干細胞相關(guān)因子△Np63α、ABCG2、CK3，及炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、MCP-1、iNOS、TGF-β、VEGF的表達量。
　　 2、以羊膜為載體人角膜緣上皮細胞體

4、外培養(yǎng)
　　 角膜來自山東省眼科研究所眼庫，取用角膜移植后剩余的角鞏膜環(huán)，將角膜上皮細胞消化成單細胞后接種于去上皮羊膜上，每天觀察細胞生長情況，待細胞鋪滿羊膜形成復(fù)層時進行移植手術(shù)。
　　 3、以羊膜為載體培養(yǎng)的人角膜緣上皮細胞移植術(shù)
　　 取堿燒傷后處于穩(wěn)定期的兔角膜進行手術(shù)。術(shù)中剪開全周球結(jié)膜，剝除角膜表面覆蓋的血管膜，將培養(yǎng)有人角膜緣上皮細胞的羊膜覆蓋于角膜表面，將羊膜于角膜緣處縫合5～8針固定于球結(jié)膜和鞏

5、膜之間。手術(shù)中注意保護細胞避免受到損傷，術(shù)畢行瞼裂縫合避免角膜過度暴露。
　　 4、手術(shù)后的臨床療效評價和供體細胞的存活狀態(tài)檢測
　　 分別于術(shù)后即刻，術(shù)后1天、3天、7天、14天、21天和28天時用裂隙燈顯微鏡觀察術(shù)后兔角膜變化，對角膜新生血管化程度和炎癥程度進行評分，并利用裂隙燈照相系統(tǒng)進行圖像記錄。在上述各時間點取兔角膜進行HE染色，并用免疫組化方法檢測供體和受體中p63、Ki-67的表達情況。用RT-PCR方法檢

6、測術(shù)前及術(shù)后各時間點供體和受體細胞中干細胞相關(guān)因子△Np63α、Ki-67、ABCG2、C/EBP△、CK3的表達量。
　　 5、手術(shù)后眼表微環(huán)境中炎癥因子表達情況檢測
　　 分別于手術(shù)后即刻、術(shù)后1天、3天、7天、14天、28天時取兔角膜，用免疫組化方法檢測CD68的表達情況，用Real time-PCR方法檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、MCP-1、iNOS、TGF-β

7、、VEGF、CD4、CD8的表達量。
　　 結(jié)果:
　　 1、堿燒傷后兔角膜的病變特征
　　 堿燒傷后燒傷部位的角膜即呈瓷白色混濁，堿燒傷后1周內(nèi)為急性期，球結(jié)膜缺血，角膜水腫，角膜上皮持續(xù)缺損，堿燒傷后第2～3周進入損傷和修復(fù)共存期。中度堿燒傷組在燒傷后4～8周時角膜新生血管化，炎癥反應(yīng)趨于穩(wěn)定;重度堿燒傷組在傷后8～12周時才能進入穩(wěn)定期。中度堿燒傷組有3眼評分未達標(biāo)而排除研究，重度堿燒傷組3眼角膜穿孔排除研

8、究。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)，中度組和重度組的總分平均值分別為5.7±1.2分和8.8±1.1分，兩組差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。HE染色可見堿燒傷后穩(wěn)定期時角膜表面覆蓋扁平的鱗狀上皮細胞，基質(zhì)內(nèi)見大量管徑粗大的新生血管，可達深基質(zhì)層。免疫組織化學(xué)檢測可見大量CD68陽性的炎癥細胞浸潤，角膜中p63表達陰性。Real time-PCR結(jié)果顯示堿燒傷組△Np63α、ABCG2、CK3的表達顯著低于正常對照組，其中重度堿燒傷組降低較中度堿燒傷組

9、降低更為顯著(P＜0.05)。堿燒傷后穩(wěn)定期角膜中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、iNOS、MCP-1、TGF-β、VEGF的表達顯著高于正常對照組。
　　 2、以羊膜為載體培養(yǎng)的兔角膜緣上皮細胞移植術(shù)后的臨床療效
　　 中度堿燒傷組在術(shù)后1～28天時均可見到角膜上皮完整，未見新生血管再次生長。重度堿燒傷組在術(shù)后1天時可見到角膜上皮片狀缺損，術(shù)后3天時角膜上皮修復(fù)完整，術(shù)后14

10、天和21天時再次出現(xiàn)角膜上皮片狀缺損，自術(shù)后14天時可見新生血管再次長入角膜，甚至比術(shù)前更為嚴(yán)重。HE染色可見術(shù)后7天內(nèi)羊膜與角膜貼附不緊密，術(shù)后14天時羊膜吸收，但此時角膜上皮細胞與角膜基質(zhì)仍有分離現(xiàn)象。中度堿燒傷組術(shù)后21天和28天時角膜上皮完整，角膜基質(zhì)內(nèi)未見新生血管管腔;重度堿燒傷組可見角膜上皮缺損，或角膜上皮不規(guī)則增生，呈鱗狀上皮化，角膜基質(zhì)內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，并可見到新生血管管腔。
　　 3、手術(shù)后供體細胞的存活狀態(tài)

11、
　　 免疫組織化學(xué)檢測在中度堿燒傷組術(shù)后28天內(nèi)均可見供體p63和Ki-67表達。重度堿燒傷組術(shù)后7天內(nèi)可見p63表達，偶見Ki-67陽性細胞，RT-PCR結(jié)果顯示兩組供體細胞中△Np63α的表達在手術(shù)后即刻降低約40％，術(shù)后3天時顯著降低，而ABCG2在術(shù)后28天內(nèi)均有表達但呈逐漸下降趨勢。中度堿燒傷組Ki-67的表達量在術(shù)后7天內(nèi)較術(shù)前升高，但術(shù)后14天時即顯著降低至消失;C/EBP△和CK3的表達量在術(shù)后即刻較術(shù)前降低，

12、但術(shù)后1天時有所上調(diào)，術(shù)后3天、7天時呈顯著下降，至術(shù)后14天后幾乎檢測不到其表達。重度堿燒傷組Ki-67、C/EBP△、CK3的表達在術(shù)后3天時即顯著降低，術(shù)后7天時表達量極低甚至消失。
　　 4、手術(shù)后眼表炎癥微環(huán)境中炎癥因子的表達
　　 HE染色和免疫組織化學(xué)結(jié)果:術(shù)后1天和3天時在羊膜下和角膜基質(zhì)中可見分葉清晰的中性粒細胞浸潤和CD68陽性的巨噬細胞浸潤，術(shù)后7天時較少見到分葉清晰的中性粒細胞，但CD68陽性細胞

13、仍較多。中度堿燒傷組術(shù)后14天后CD68陽性細胞逐漸減少，而重度堿燒傷組CD68陽性細胞浸潤可持續(xù)至術(shù)后28天。
　　 Real-time PCR結(jié)果:炎癥因子IL-1β、IL-6、MCP-1、IL-13、IL-10的表達在術(shù)后即刻即顯著上調(diào)，術(shù)后3天時顯著下調(diào)，術(shù)后7天和14天再次上調(diào)，隨后逐漸下降。大部分炎癥因子在術(shù)后出現(xiàn)兩個高峰，即術(shù)后即刻和術(shù)后7天時。CD4和CD8的表達在術(shù)后1天、3天均處在極低水平，術(shù)后7天時驟然上調(diào)

14、，此后下降。
　　 5、手術(shù)后受體中干細胞相關(guān)因子的表達
　　 中度堿燒傷組△Np63α、ABCG2、CK3、Ki-67的表達在術(shù)后較術(shù)前呈上調(diào)趨勢，在術(shù)后21天時較為顯著。重度堿燒傷組△Np63α、ABCG2、CK3、Ki-67在術(shù)后的表達量沒有超過術(shù)前，在術(shù)后早期如1天、3天、7天時甚至較術(shù)前降低。
　　 結(jié)論:
　　 1、角膜緣環(huán)形堿燒傷是建立角膜緣干細胞缺乏模型的有效方法，在堿燒傷后穩(wěn)定期角膜內(nèi)仍

15、有大量巨噬細胞浸潤和多種炎癥因子高表達，中度堿燒傷角膜緣內(nèi)可能殘存一些可恢復(fù)功能的干細胞。
　　 2、移植的供體細胞在術(shù)后7天內(nèi)可維持其增殖、分化和自我更新能力，隨后細胞的各項功能均下降至喪失。
　　 3、術(shù)后早期的炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)是影響移植的供體細胞功能的關(guān)鍵因素，巨噬細胞可能在其中發(fā)揮了主要作用。
　　 4、有足夠的供體細胞長期存活并發(fā)揮正常功能是術(shù)后維持穩(wěn)定眼表的一個必要條件，而受體自身殘存足夠的可恢