Bcl-2,Bcl-xlsiRNA對HepG2細胞藥物敏感性的影響.pdf

1、目的:觀察Bcl-2 siRNA和Bcl-xl siRNA對人類肝癌細胞HepG2藥物敏感性的影響和作用機制。
　　方法:堿裂解法提取psiBcl-2和psiBcl-xl載體,共轉(zhuǎn)染到肝癌細胞HepG2中,用G418篩選穩(wěn)定的陽性細胞克隆,克隆擴大培養(yǎng)。用RT-PCR檢測Bcl-2、Bcl-xlmRNA水平,免疫熒光檢測目的基因Bcl-2、Bcl-xl蛋白水平的表達。用不同濃度的5-FU和HCPT處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞,用MTT觀察細胞

2、對藥物敏感性的影響。用一種藥物濃度處理細胞,用流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡情況。Western blot檢測Bcl-2、Bcl-xl、Bax和caspase-3蛋白,觀察目的基因Bcl-2和Bcl-xl沉默后對Bax、caspase-3蛋白水平的影響。
　　結(jié)果:RT-PCR檢測到目的基因Bcl-2 mRNA在Bcl-2 siRNA轉(zhuǎn)染組和Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA共轉(zhuǎn)染組均減低,而在正常細胞組,陰性載體轉(zhuǎn)染組和B

3、cl-xl siRNA轉(zhuǎn)染組Bcl-2 mRNA的水平無變化;Bcl-xl mRNA在Bcl-xl siRNA轉(zhuǎn)染組和Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA共轉(zhuǎn)染組均減低,而在正常細胞組,陰性siRNA載體轉(zhuǎn)染組和Bcl-2 siRNA轉(zhuǎn)染組Bcl-xl mRNA的水平無變化。免疫熒光顯示在Bcl-2 siRNA和Bcl-xl siRNA轉(zhuǎn)染組目的基因的熒光強度較正常細胞和陰性載體轉(zhuǎn)染的細胞明顯減弱。用不同濃度的5-FU(13

4、、130、1300、13000mg/L)處理細胞24h后MTT結(jié)果顯示Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA共轉(zhuǎn)染組、Bcl-2 siRNA、Bcl-xl siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞生長抑制率明顯高于陰性載體轉(zhuǎn)染組和正常細胞(28.07±1.98％,23.30±4.08%,21.13±2.24% vs7.37±1.17% or7.65±0.64%;38.01±1.26%,30.93±1.89%,28.87±0.74% vs21.9

5、5±3.47% or22.10±2.01%;63.63±0.56%,37.62±0.76%,37.11±1.09% vs29.27±2.03%or30.10±1.86%;73.10±0.86%,63.40±3.08%,61.86±2.20% vs40.98±2.40% or41.15±1.19% P<0.05);當不同濃度的HCPT(018,0.36,0.72,1.44mg/L)孵育細胞24小時后, MTT結(jié)果表明Bcl-2 siRNA

6、/Bcl-xl siRNA共轉(zhuǎn)染組、Bcl-2 siRNA、Bcl-xl siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞生長抑制率明顯高于陰性載體轉(zhuǎn)染組和正常細胞(25.92±3.18%,19.02±2.06%,19.02±1.54% vs10.97±0.65%or10.40±0.43%;51.85±1.02%,46.91±0.98%,46.01±2.75% vs27.11±2.13% or26.82±1.78%;63.70±1.16%,54.32±0.45%

7、,53.38±2.96% vs47.98±1.78% or47.98±0.88%;75.29±1.95%,61.73±0.67%,58.90±1.78% vs53.18±1.36% or52.60±2.03% P<0.05)。5-FU或HCPT藥物的IC50值在Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA、Bcl-2 siRNA、Bcl-xl siRNA細胞較正常細胞和陰性轉(zhuǎn)染組均有明顯降低,Bcl-xl siRNA轉(zhuǎn)染組與Bcl-

8、2 siRNA轉(zhuǎn)染組無明顯差異,且加5-FU時Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA CI值為0.214(CI小于1),加HCPT時Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA CI值為0.945(CI小于1),表明Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA具有協(xié)同作用。流式細胞術(shù)結(jié)果表明細胞凋亡率在Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA,Bcl-2 siRNA,Bcl-xl siRNA轉(zhuǎn)染組高于正常細胞和

9、陰性載體轉(zhuǎn)染組;而且Bcl-2 siRNA/Bcl-xl siRNA共轉(zhuǎn)染組高于Bcl-2 siRNA,Bcl-xl siRNA轉(zhuǎn)染組。Western blot結(jié)果表明在Bcl-2和Bcl-xl表達下調(diào)時,Bax蛋白表達水平不變而caspase-3蛋白活性增強。
　　結(jié)論:1.RNAi下調(diào)目的基因Bcl-2和Bcl-xl能增強人類肝癌細胞HepG2對化療藥物5-FU和HCPT的敏感性。2.HepG2細胞對5-FU和HCPT敏感性增